Hoàng thảo kèn (Dendrobium lituiflorum Lindl.) là loài lan rừng đặc hữu và quý hiếm của Việt Nam. Nghiên cứu này xây dựng quy trình nhân giống in vitro cây hoàng thảo kèn bao gồm phát sinh PLBs từ chồi, tái sinh chồi, tạo rễ. Chồi in vitro được nuôi cấy trên môi trường MS bổ sung TDZ ở các nồng độ khác nhau để phát sinh protocorm like bodies (PLBs). Ở nồng độ TDZ 2,0 mg/l cho tỷ lệ phát sinh PLBs cao nhất.
Chồi phát sinh tốt nhất trên môi trường MS có bổ sung TDZ 1,5mg/l. Môi trường MS có bổ sung NAA 0,5 mg/l thích hợp để tạo rễ in vitro. Kết quả này có thể được sử dụng trong nhân giống cây hoàng thảo kèn ở quy mô lớn cũng như tạo tiền đề cho những nghiên cứu tiếp theo trên đối tượng này.
Từ khóa: Dendrobium lituiflorum, NAA, PLBs, TDZ, vi nhân giống.
1. ĐẶT VẤN ĐỀ
Việt Nam là quốc gia nhiệt đới, thích hợp cho sự phát triển của các loài lan. Lan rừng ở nước ta rất phong phú với nhiều chủng loại. Nhiều loài mới được phát hiện mô tả gần đây như Bulbophyllum paraemarginatum, Bulbophyllum sinhoense, Cheirostylis foliosa, Goodyera rhombodoides,… (Leonid, 2007). Trong đó hoàng thảo (Dendrobium) là chi phổ biến và có giá trị về nhiều mặt (Đào Thanh Vân và Đặng Thị Tố Nga, 2008). Tại Việt Nam, có khoảng 107 loài hoàng thảo đã được xác định.
Hoàng thảo kèn (Dendrobium lituiflorum Lindl.) là lan rừng đặc hữu của nước ta. Đây là một trong những loài lan đẹp và quý hiếm. Ngày nay, do nạn phá rừng và khai thác quá mức, hoàng thảo kèn đang mất dần trong tự nhiên. Vì thế nếu không có những biện pháp bảo vệ và nhân giống kịp thời, loài lan này có nguy cơ tuyệt chủng (Chowdhery, 2001).
Phương pháp nhân giống lan bằng phương pháp truyền thống (gieo hạt, tách bụi,…) mất nhiều thời gian và không hiệu quả (Martin và Madassery, 2006). Dựa trên tính toàn năng của tế bào thực vật, kỹ thuật nuôi cấy mô là phương pháp được sử dụng trong nhân giống các cây trồng có giá trị với khả năng tạo ra số lượng lớn trong thời gian ngắn với chi phí thấp, tỷ lệ cây sống cao. Đây là biện pháp góp phần bảo vệ, phát triển nguồn gen của loài thực vật quý hiếm này (Hazarika, 2006).
Trên thế giới đã có một số công bố nhân giống hoàng thảo kèn. Năm 2004, Chang và cộng sự đã nghiên cứu thành công môi trường và các điều kiện nuôi cấy lan hoàng thảo kèn từ hạt qua quá trình phát sinh PLBs. Năm 2008, Meera và cộng sự đã nghiên cứu quy trình nhân 28 giống in vitro Dendrobium lituiflorum Lindl. Qua con đường phát sinh PLBs. Năm 2009, Shivani và cộng sự đã nghiên cứu môi trường nhân nhanh lan hoàng thảo kèn bổ sung dịch chiết chuối trên môi trường KC. Chưa thấy công bố của các tác giả Việt Nam trong nhân giống in vitro loài lan này. Nghiên cứu này của chúng tôi nhằm xây dựng quy trình nhân giống in vitro cây hoàng thảo kèn phục vụ cho mục đích nhân giống cây này ở quy mô lớn.
2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.1. VẬT LIỆU
Nghiên cứu sử dụng chồi in vitro hoàng thảo kèn sau 60 ngày gieo hạt đang lưu giữ tại Phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học Thực vật – Trường ĐH Công nghiệp Thực phẩm Tp.HCM.
2.2. PHƯƠNG PHÁP
Khử trùng hạt, gieo hạt tạo chồi in vitro
Quả lan được rửa sạch dưới vòi nước chảy, sau đó rửa lại với xà phòng loãng trong 20 phút. Tiếp theo quả được ngâm trong cồn 70o trong 2 phút, cuối cùng ngâm trong dung dịch javel 30% trong 10 phút với và rửa lại 3 lần với nước cất vô trùng. Sau khi khử trùng, dùng dao cắt dọc theo chiều dài của quả lan, tách lấy hạt và cấy lên môi trường MS có chứa 20 g/l saccharose, 8 g/l agar, 150 ml/l nước dừa và bổ sung 0,5 mg/l BA để tạo chồi.
Phát sinh PLBs từ chồi: Khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ TDZ lên sự phát sinh PLBs
Đoạn chồi in vitro được cấy vào môi trường MS cơ bản có bổ sung 150 ml/l nước dừa, 20 g/l đường saccharose, 8 g/l agar, bổ sung TDZ ở các nồng độ khác nhau (0 ÷ 3,0 mg/l) để phát sinh PLBs.
Tái sinh chồi: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ BA, TDZ lên sự tái sinh chồi từ PLBs
PLBs được cấy vào môi trường MS cơ bản có chứa 150 ml/l nước dừa, 20 g/l đường saccharose, 8 g/l agar và bổ sung BA ở các nồng độ khác nhau (0 ÷ 2,5 mg/l), TDZ ở các nồng độ khác nhau (0 ÷ 2,5 mg/l) để tái sinh chồi.
Tạo rễ: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ NAA lên sự tạo rễ
Chồi in vitro đã đủ 2 – 3 lá thật, chiều cao khoảng 2 – 3 cm được cắt bỏ rễ, sau đó cấy vào môi trường MS cơ bản có chứa 150 ml/l nước dừa, 20 g/l đường saccharose, 8 g/l agar và bổ sung NAA các nồng độ khác nhau (0 ÷ 2,0 mg/l) để tạo rễ.
Môi trường nuôi cấy là môi trường MS cơ bản (Murashige và Skoog, 1962) có bổ sung 20 g/l saccharose, 8 g/l agar, các chất điều hòa tăng trưởng thực vật tùy theo từng thí nghiệm, pH được điều chỉnh = 5,8 trước khi hấp khử trùng.
Thời gian chiếu sáng: 16h/ngày, cường độ chiếu sáng: 2500±200 lux, nhiệt độ: 25±20C, độ ẩm trung bình: 70±2%.
Bố trí thí nghiệm và xử lý số liệu:
Các thí nghiệm được bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên (CRD) với 5 lần lặp lại. Số liệu thu thập được xử lý bằng phần mềm Statgraphics Centurion XV.I, sử dụng trắc nghiệm đa biên độ Duncan với độ tin cậy 95%.
3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Phát sinh PLBs từ chồi: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ TDZ lên sự phát sinh PLBs
Kết quả phát sinh PLBs sau 45 ngày nuôi cấy được trình bày ở bảng 1.
Bảng 1. Ảnh hưởng của nồng độ TDZ lên sự tái sinh PLBs
Kết quả cho thấy trên môi trường có bổ sung TDZ tất cả mẫu cấy đều tạo PLBs. Môi trường đối chứng (không bổ sung TDZ) không tạo PLBs. Điều này chứng tỏ TDZ có hiệu quả trong kích thích tạo PLBs từ chồi hoàng thảo kèn. Nồng độ 2,0 mg/l TDZ cho tỉ lệ phát sinh PLBs cao nhất (52%). PLBs bắt đầu hình thành sau 22 ngày nuôi cấy. Khi tăng nồng độ TDZ từ 2 đến 3 mg/l, tỷ lệ phát sinh PLBs có xu hướng giảm, PLBs già hoá nhanh. Có thể do TDZ là chất có hoạt tính cytokinin và cũng có hoạt tính auxin nên khi sử dụng ở nồng độ cao thường gây ức chế sự tái sinh của mẫu dẫn đến hiện tượng mẫu chuyển sang màu vàng nâu (Dương Tấn Nhựt, 2011).
Kết quả này cũng phù hợp với nghiên cứu của Panjan và Kamnoon (2011) phát sinh PLBs trên lan Dendrobium Dwarf trên môi trường có bổ sung 18µM TDZ cho hiệu quả phát sinh cao nhất với tỷ lệ 86,4% sau 9 tuần nuôi cấy.
A. 0,0 mg/l; B. 0,5 mg/l; C. 1,0 mg/l; D.1,5 mg/l; E. 2,0 mg/l; F. 2,5 mg/l; G. 3,0 mg/l 30
3.2. Tái sinh chồi: Khảo sát ảnh hưởng của BA, TDZ lên sự tái sinh chồi từ PLBs
Kết quả tái sinh chồi từ PLBs sau 45 ngày nuôi cấy được trình bày ở bảng 2 và hình 3.
Bảng 2. Ảnh hưởng của nồng độ BA, TDZ lên sự tái sinh chồi từ PLBs.
Kết quả thí nghiệm cho thấy trên môi trường MS bổ sung nồng độ BA và TDZ khác nhau
cho thấy sự khác biệt rõ rệt giữa các nghiệm thức. Đối với khả năng tạo chồi ở cây lan hoàng thảo kèn thì BA tỏ ra kém hiệu quả hơn TDZ
Sau 45 ngày nuôi cấy, trên môi trường không bổ sung BA và TDZ các mẫu PLBs vẫn cảm ứng tạo chồi. Tuy nhiên chồi mới xuất hiện chậm, số lượng ít, kích thước to và có rễ. Trên các môi trường có bổ sung TDZ đều có sự hình thành chồi mới. Khi tăng nồng độ TDZ (0÷) số lượng chồi hình thành tăng dần. Khả năng tạo chồi cao nhất đạt được trên môi trường bổ sung 1,5 mg/l TDZ. Tỷ lệ mẫu cấy tạo chồi có xu hướng giảm khi tiếp tục tăng nồng độ TDZ đến 2,5 mg/l, những chồi tạo ra có hình dạng không rõ ràng. Do TDZ là một chất có hoạt tính cytokinin mạnh và cũng có hoạt tính auxin nên khi dùng ở nồng độ cao sẽ gây ức chế sự tái sinh của mẫu (Dương Tấn Nhựt, 2011). Kết quả này cũng phù hợp với nghiên cứu của Nguyễn Thanh Tùng và cộng sự (2010) khi sử dụng TDZ để tái sinh chồi từ PLBs lan hoàng thảo thân gãy (Dendrobium aduncum). Kết quả cho thấy trên môi trường TDZ bổ sung 2,0 mg/l TDZ cho hiệu quả tái sinh cao nhất (3 chồi/mẫu). Nhìn chung, trên môi trường có bổ sung TDZ khả năng tái sinh chồi cao và nhanh, tuy nhiên có chồi tạo ra nhỏ, thấp và không đồng đều. Trên môi trường có bổ sung BA, chồi tái sinh từ PLBs chậm hơn và số lượng chồi tạo ra trên mẫu ít hơn so với trên TDZ. Điều này tạo thuận lợi cho quá trình kéo dài chồi bởi các chồi không phải cạnh tranh dinh dưỡng, do đó các chồi hấp thụ được lượng dinh dưỡng cần 31 thiết và phát triển cao hơn. Khi tăng nồng độ BA từ 0÷2,5 mg/l số lượng chồi tăng dần. Trên môi trường có bổ sung 2,5 mg/l BA cho số chồi được tạo thành cao nhất (41,3 chồi/mẫu).
A. 0,0 mg/l; B. 0,5 mg/l; C. 1,0 mg/l; D.1,5 mg/l; E. 2,0 mg/l; F. 2,5 mg/l
A. 0,0 mg/l; B. 0,5 mg/l; C. 1,0 mg/l; D.1,5 mg/l; E. 2,0 mg/l; F. 2,5 mg/l
Tạo rễ: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ NAA lên sự tạo rễ
Kết quả tạo rễ sau 30 ngày nuôi cấy được trình bày ở bảng 3
Bảng 3. Ảnh hưởng của nồng độ NAA lên sự tạo rễ cây hoàng thảo kèn
Kết quả cho thấy môi trường không bổ sung NAA rễ vẫn hình thành. Điều này chứng tỏ auxin nội sinh được hình thành ở chồi và di chuyển xuống dưới gốc để cảm ứng tạo rễ. A B C D E F 0,5 cm 0,5 cm 0,5 cm 0,5 cm 0,5 cm 0,5 cm 32 Tất cả các môi trường có bổ sung NAA đều hình thành rễ. Ở môi trường bổ sung NAA ở nồng độ 0,5 mg/l và 1 mg/l cho số lượng rễ hình thành khá cao, xung quanh rễ có một lớp mô hút ẩm dày, màu xám bạc, chóp rễ có màu xanh điều này thuận lợi cho sự phát triển của chồi và rễ ở giai đoạn vườn ươm. Tiếp tục tăng nồng độ NAA từ 1,0÷2,0 mg/l, có sự ức chế kéo dài rễ và giảm số lượng rễ tạo thành. Có thể do auxin ở nồng độ cao sẽ kích thích sự tạo sơ khởi rễ nhưng sẽ cản trở sự tăng trưởng của các sơ khởi này (Võ Thị Bạch Mai, 2004). Kết quả này cũng phù hợp với nghiên cứu của Nguyễn Thị Sơn và cộng sự (2014) khi sử dụng NAA ở nồng độ 0,5 mg/l cho quá trình ra rễ in vitro lan thạch hộc thiết bì (Dendrobium officinale Kimura et Migo). Nghiên cứu của Priya và cộng sự (2013) trên lan Denbium sonia ‘Earsakul’ cho thấy bổ sung NAA cho tỷ lệ tạo rễ cao hơn so với môi trường bổ sung IAA và IBA. Chồi tạo rễ tốt trên môi trường ½MS có bổ sung 0,5 mg/l NAA, khi tăng nồng độ NAA từ 0,5÷2 mg/l sự tạo thành rễ bị ức chế. Một nghiên cứu khác của Dake và cộng sự (2013) trên lan Dendrobium wangliangii cho kết quả chồi cảm ứng ra rễ tốt nhất trên môi trường ½MS bổ sung 0,5 mg/l NAA.
4. KẾT LUẬN
Nghiên cứu này bước đầu đã khảo sát một vài thông số môi trường trong quy trình nhân giống in vitro cây hoàng thảo kèn. PLBs được tái sinh từ chồi in vitro trên môi trường MS có bổ sung TDZ 2,0 mg/l. PLBs sau 45 ngày được chuyển sang môi trường MS có bổ sung TDZ 1,5 mg/l để tái sinh chồi. Môi trường tạo rễ tốt nhất là MS có bổ sung NAA 0,5 mg/l.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Chang J., Ding X.Y., Bao S.L., Liu D.Y., He J., Tang F. ans Ding B.Z. (2004). Studies on tissue culture of Dendrobium lituiflorum. China Journal of Chinese Material Medica, 29(4): 313-317.
2. Chowdhery H.J. (2001). Orchid diversity in North-East India. J. Orchid Soc. India 15: 1-17.
3. Dake Z., Guangwan H., Zhiying C., Yana S., Li Z., Anjun T. and Chunlin L. (2013). Micropropagation and in vitro flowering of Dendrobium wangliangii: A critically endangered. Journal of Medicinal Plants Research, 7(28): 2098-2110.
4. Hazarika B.N. (2006). Morpho-physiological disorders in in vitro culture of plants. Sci. Hort., 108: 105-120. 33
5. Leonid V.A. (2007). New species of orchids from Vietnam. International Journal of Life Sciences, 52(4): 287-306.
6. Võ Thị Bạch Mai (2004). Sự phát triển chồi và rễ. NXB Đại học Quốc gia TP. Hồ Chí Minh.
7. Martin K.P., Madassery J. (2006). Rapid in vitro propagation of Dendrobium hybrids through direct shoot formation from foliar explants and protocorm like bodies. Sci. Hort., 108: 95-99.
8. Meera C.D., Suman K. and Pramod T. (2008). In vitro propagation and conservation of Dendrobium lituiflorum Lindl. through protocorm like bodies. Journal of Plant Biochemistry and Biotechnology, 17(2): 177-181.
9. Murashige T. and Skoog F., (1962). A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Plant Physiol., 15: 473-497.
10. Dương Tấn Nhựt (2011). Công nghệ sinh học thực vật: Nghiên cứu cơ bản và ứng dụng. NXB Nông nghiệp.
11. Panjan S. and Kamnoon K.(2011). Efficient direct protocorm-like bodies induction of Dwarf Dendrobium using Thidiazuron. Notulae Scientia Biologicae, 3(4): 88-92.
12. Priya K.I., Sabina G.T. and Rajmohan K. (2013). Influence of plant growth regulators on in vitro clonal propagation of Dendrobium sonia ‘EARSAKUL’. Bio. Innov., 2(2): 51-58.
13. Shivani V., Satyakam G., Minakshi B. and Usha R.(2009). Rapid regeneration of plants of Dendrobium lituiflorum Lindl. (Orchidaceae) by using banana extract. Scientia Horticulturae, 121: 32-37.
14. Nguyễn Thị Sơn, Từ Bích Thuỷ, Đặng Thị Nhàn, Nguyễn Thị Lý Anh, Hoàng Thị Nga, Nguyễn Quang Thạch (2014). Nhân giống in vitro lan Dendrobium officinale Kimura et Migo. Tạp chí Khoa học và Phát triển, 12(8): 1274-1282.
15. Nguyễn Thanh Tùng, Lê Văn Điệp, Nguyễn Minh Trung, Trương Thị Bích Phượng (2010). Áp dụng phương pháp nuôi cấy lát mỏng tế bào trong nhân giống in vitro lan hoàng thảo thân gãy (Dendrobium aduncum). Tạp chí Công nghệ Sinh học, 8(3): 361- 367.
16. Đào Thanh Vân, Đặng Thị Tố Nga (2008). Giáo trình hoa lan. NXB Nông nghiệp.
Nguồn: Phạm Văn Lộc, Lê Thị Hoài Thương Trường Đại học Công nghiệp TP.HCM.NHÂN GIỐNG IN VITRO LAN HOÀNG THẢO KÈN(DENDROBIUM LITUIFLORUM Lindl.)