ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊNTRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC
NGUYỄN THU HƢỜNG
NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG IN VITROLAN HOÀNG THẢO PHI ĐIỆP TÍM(DENDROBIUM ASOMUM LINDL.)
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG
THÁI NGUYÊN – 2016
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊNTRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC
NGUYỄN THU HƢỜNG
NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG IN VITROLAN HOÀNG THẢO PHI ĐIỆP TÍM
(DENDROBIUM ASOMUM LINDL.)Chuyên ngành: Công nghệ Sinh họcMã số: 60.42.02.01
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG
Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS. Nguyễn Thị Hải Yến
THÁI NGUYÊN – 2016
iLỜI CAM ĐOANTôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi thực hiện dướisự hướng dẫn của TS. Nguyễn Thị Hải Yến. Mọi trích dẫn trong luận văn đềughi rõ nguồn gốc. Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thựcvà chưa từng có ai công bố trong một công trình nào khác.Thái Nguyên, tháng 11 năm 2016Tác giả luận văn
Nguyễn Thu Hƣờng
iiLỜI CẢM ƠNLời đầu tiên tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới TS.Nguyễn Thị Hải Yến, Giảng viên Khoa Khoa học Sự sống, Trường Đại họcKhoa học Thái Nguyên, người đã trực tiếp hướng dẫn tận tình chu đáo và tạomọi điều kiện thuận lợi giúp tôi hoàn thành luận văn này.Đồng thời, tôi xin được cảm ơn các thầy, cô giáo và các cán bộ kỹ thuậtviên Phòng thí nghiệm Sinh học của Khoa Khoa học Sự sống đã tạo điều kiệnvề thời gian cũng như cơ sở vật chất cho tôi trong suốt quá trình học tập vàlàm luận văn thạc sĩ.Cuối cùng tôi xin cảm ơn gia đình, bạn bè cùng tất cả các thầy cô luônluôn động viên, khuyến khích và giúp đỡ tôi trong tiến trình tôi học tập và làmluận văn này.Trong quá trình làm luận văn không tránh khỏi những sai sót, tôi mongnhận được sự đóng góp quý báu từ phía thầy cô và bạn bè để tôi có thể cóđược kết quả tốt hơn.Thái Nguyên, tháng 11 năm 2016
Tác giả luận văn
Nguyễn Thu Hƣờng
iiiMỤC LỤCLỜI CAM ĐOAN …………………………………………………………………………………. iLỜI CẢM ƠN ……………………………………………………………………………………… iiMỤC LỤC ………………………………………………………………………………………….. iiiDANH MỤC TỪ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU …………………………………………… vDANH MỤC CÁC BẢNG……………………………………………………………………. viDANH MỤC CÁC HÌNH ……………………………………………………………………. viiMỞ ĐẦU ……………………………………………………………………………………………. 11. Đặt vấn đề………………………………………………………………………………………… 12. Mục tiêu nghiên cứu ………………………………………………………………………….. 23. Nội dung nghiên cứu …………………………………………………………………………. 2Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU …………………………………………………… 31.1. Giới thiệu chung về phong lan …………………………………………………………. 31.1.1. Chi lan Hoàng thảo (Dendrobium)…………………………………………………. 41.1.2. Lan Hoàng thảo phi điệp tím (Dendrobium anosmum Lindl.) …………… 71.1.3. Các phương pháp nhân giống trên cây lan ………………………………………. 91.2. Sơ lược về nuôi cấy mô tế bào thực vật …………………………………………… 101.2.1. Các hướng nghiên cứu ứng dụng và ưu thế của kĩ thuật nuôi cấymô – tế bào …………………………………………………………………………………………. 101.2.2. Các phương thức nuôi cấy mô tế bào trong nhân giống vô tính ……….. 111.2.3. Các giai đoạn của nhân giống in vitro…………………………………………… 121.2.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy mô ………………………….. 131.3. Một số nghiên cứu nhân giống in vitro lan Dendrobium ……………………. 141.3.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới ……………………………………………….. 151.3.2. Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam ……………………………………………… 16Chƣơng 2:
…………….. 18
2.1. Vật liệu ……………………………………………………………………………………….. 18………………………………………………………………………… 182.1.2. Dụng cụ và hóa chất …………………………………………………………………… 18
iv2.1.3. Thời gian và địa điểm nghiên cứu………………………………………………… 192.2. Phương pháp nghiên cứu ……………………………………………………………….. 192.2.1. Phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật …………………………………….. 192.2.2. Chuẩn bị môi trường nuôi cấy……………………………………………………… 202.2.3. Chuẩn bị một số thành phần bổ sung vào môi trường nuôi cấy ……….. 212.2.4. Chuẩn bị giá thể và ra cây …………………………………………………………… 212.2.5. Điều kiện nuôi cấy in vitro ………………………………………………………….. 212.2.6. Bố trí thí nghiệm ……………………………………………………………………….. 212.2.7. Các chỉ tiêu theo dõi …………………………………………………………………… 242.2.8. Xử lý số liệu ……………………………………………………………………………… 24Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN …………………………………………… 253.1. Kết quả khử trùng mẫu đưa vào nuôi cấy ………………………………………… 253.1.1. Kết quả khử trùng mẫu hạt phong lan …………………………………………… 253.2. Kết quả tái sinh chồi ……………………………………………………………………… 263.2.1. Kết quả tái sinh chồi từ hạt lan Hoàng thảo phi điệp tím ………………… 263.2.2. Kết quả nhân chồi từ protocorm lan Hoàng thảo phi điệp tím …………. 283.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của một số kích thích sinh trưởng nhómCytokinin đến sự nhân nhanh cụm chồi lan Hoàng thảo phi điệp tím ………… 293.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng khoai tây và chuối xanh đếnsự nhân nhanh lan Hoàng thảo phi điệp tím (Dendrobium AnosmumLindl.) ……………………………………………………………………………………………….. 333.5. Nghiên cứu ảnh hưởng α – NAA đến khả năng ra rễ Hoàng thảo phiđiệp tím ……………………………………………………………………………………………… 353.6. Ảnh hưởng chế phẩm dinh dưỡng đến sinh trưởng và phát triển củacây lan sau khi ra chai trồng trong bầu ………………………………………………….. 37KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ……………………………………………………………. 401. Kết luận …………………………………………………………………………………………. 402. Kiến nghị ……………………………………………………………………………………….. 40TÀI LIỆU THAM KHẢO …………………………………………………………………. 41
vDANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮTChữ viết tắt
Chữ viết đủ
ABA
Abscisic acid
ADN
Acid deoxyribonucleic
APG III
Angiosperm Phylogeny Group III
B1
Thiamine
B2
Riboflavin
BAP
6 – Benzyl adenin purine
ĐC
Đối chứng
EAC
Ehrlich ascites cells
GA3
Gibberellic acid
IAA
Indol – 3 – acetic acid
IBA
Indol – 3 – butyric acid
Kinetin
6 – furfurryl – aminopurin
KTST
Kích thích sinh trưởng
MS
Murashige and Skoog
PM
Phytamax
RE
Robert Ernst
THT
Than hoạt tính
VW
Vacin Went
USA
United States of America
2,4 – Dichlorophenoxy acetic acidα – Naphthalene acetic acid
CT
Công thức
TG
Thời gian
KT
Khử trùng
viDANH MỤC CÁC BẢNGBảng 3.1. Kết quả khử trùng hạt lan Hoàng thảo phi điệp tím bằngHgCl2 0,1% …………………………………………………………………………. 25Bảng 3.2. Kết quả protocorm phát sinh từ hạt Hoàng thảo phi điệp tím …….. 27Bảng 3.3. Kết quả nhân chồi từ protocorm loài lan Hoàng thảo phi điệptím sau 50 ngày cấy chuyển …………………………………………………… 29Bảng 3.4. Ảnh hưởng của nhóm Cytokinin đến sự nhân nhanh chồi lanHoàng thảo phi điệp tím………………………………………………………… 30Bảng 3.5. Ảnh hưởng của hàm lượng chuối xanh và khoai tây nghiềnđến sự nhân nhanh cụm chồi lan Hoàng thảo phi điệp tím sau30 ngày ……………………………………………………………………………….. 34Bảng 3.6. Ảnh hưởng của α – NAA đến khả năng tạo rễ của lan Hoàngthảo phi điệp tím ………………………………………………………………….. 36Bảng 3.7. Ảnh hưởng chế phẩm dinh dưỡng đến sự sinh trưởng pháttriển của cây ………………………………………………………………………… 38
viiDANH MỤC CÁC HÌNHHình 1.1. Hoa và cây phong lan Hoàng thảo phi điệp tím ………………………….. 9Hình 2.1. Quả loài lan Hoàng thảo phi điệp tím ……………………………………… 20Hình 3.1. Hạt Hoàng thảo phi điệp tím nảy mầm trên môi trường MSchứa 2,0 mg/l BAP sau 30 ngày nuôi cấy ………………………………… 26Hình 3.2. Protocorm của lan Hoàng thảo phi điệp tím được tạo thành từhạt trên môi trường MS chứa 2,0 mg/l BAP …………………………….. 27Hình 3.3. Chồi phát sinh từ protocorm trên môi trường MS chứa 1,5 mg/l BAP …. 29Hình 3.4. Ảnh hưởng của BAP và kinetin tới sự nhân nhanh cụm chồilan Hoàng thảo phi điệp tím sau 60 ngày ………………………………… 33Hình 3.5. Ảnh hưởng của chuối xanh và khoai tây lên sự nhân nhanhcụm chồi lan Hoàng thảo phi điệp tím sau 60 ngày …………………… 35Hình 3.6. Ảnh hưởng của α – NAA đến khả năng tạo rễ của lan sau 30 ngày…. 37Hình 3.7. So sánh sự ảnh hưởng từ chế độ tưới ½ MS tới sinh trưởng vàphát triển của cây lan con so với đối chứng sau 60 ngày …………… 38
1MỞ ĐẦU1. Đặt vấn đềNgày nay, hoa cảnh không những đóng vai trò quan trọng trong đờisống tinh thần mà còn ảnh hưởng sâu sắc đến tâm hồn con người và làm đẹpcho cảnh quan môi trường. Do đó, quan tâm phát triển hoa cảnh là vấn đề cầnthiết. Hoa lan là một trong những loại hoa được ưa chuộng nhất vì hình dáng,màu sắc, kích thước phong phú, đa dạng nên chúng được trồng, sản xuất kháphổ biến và đã trở thành một mặt hàng có giá trị trong kinh doanh, xuất khẩutrên thế giới. Các nước có ngành nuôi trồng hoa lan phát triển, hàng năm kimngạch xuất khẩu lên đến hàng trăm triệu USD [15].Việt Nam là một quốc gia thuộc vùng khí hậu nhiệt đới thích hợp chosự phát triển của các loài phong lan. Theo cuốn Phong lan Việt Nam của TrầnHợp thì nước ta có 137 – 140 chi với trên 1000 loài phong lan, mỗi loài lanđều có vẻ đẹp riêng. Lan rừng tuy không rực rỡ về màu sắc như những giốnglan ngoại nhập nhưng lại có vẻ đẹp tự nhiên thanh thoát và phần lớn có hươngthơm vì vậy luôn được người chơi lan ưa chuộng. Thế giới lan rừng rất phongphú với nhiều chủng loại, một trong những chi phổ biến nhất là chi Hoàngthảo (Dendrobium). Hiện nay, Dendrobium được trồng nhiều và có giá trịkinh tế cao bởi bên cạnh giá trị thẩm mỹ mà Dendrobium đem lại thìDendrobium còn được tách chiết để phục vụ cho một số ngành công nghiệpmỹ phẩm, y học. Với giá trị như vậy hoa lan Dendrobium hứa hẹn sẽ mang lạinguồn doanh thu to lớn cho ngành sản xuất, kinh doanh mặt hàng này.Trên thị trường hiện nay, phong lan chủ yếu được cung cấp dưới dạngcây giống khai thác từ rừng, còn hạt lan rất khó nảy mầm ở điều kiện tự nhiênvì vậy số lượng cây con mọc ra không nhiều. Ngày nay, với công nghệ nhângiống in vitro, người ta có thể tạo ra từ vài nghìn đến hàng triệu cây con ổnđịnh về mặt di truyền từ một quả lan, từ đó góp phần bảo tồn và phát triểnnguồn gen của các loài lan Việt Nam. Nhờ ứng dụng nhân giống in vitro vàochi Dendrobium đã làm cho nó trở thành một loài hoa cắt cành hiệu quả.
2Từ các lý do trên, chúng tôi đã tiến hành đề tài “Nghiên cứu nhângiống in vitro lan Hoàng thảo phi điệp tím (Dendrobium anosmum Lindl.)”nhằm mục đích góp phần bảo tồn và nhân nhanh giống lan rừng bằng phươngpháp in vitro.2. Mục tiêu nghiên cứuNghiên cứu quy trình nhân nhanh giống loài lan rừng Dendrobiumanosmum Lindl. (Hoàng thảo phi điệp tím) nhằm bảo tồn nguồn gene quýhiếm và nhân giống lan rừng Việt Nam bằng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào.3. Nội dung nghiên cứu– Nghiên cứu đưa mẫu lan Hoàng thảo phi điệp tím vào nuôi cấy in vitro.– Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất kích thích sinh trưởng thựcvật lên quá trình tái sinh chồi từ phôi hạt của loài lan Hoàng thảo phi điệp tím.– Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất kích thích sinh trưởng thuộcnhóm cytokinin lên quá trình nhân nhanh lan Hoàng thảo phi điệp tím(Dendrobium anosmum Lindl.).– Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng khoai tây và chuối xanh đến sựnhân nhanh lan Hoàng thảo phi điệp tím (Dendrobium Anosmum Lindl.)– Nghiên cứu ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng thuộc nhómauxin lên quá trình hình thành rễ lan Hoàng thảo phi điệp tím (Dendrobiumanosmum Lindl.).– Tìm hiểu tác dụng của một số chế phẩm lên sự sinh trưởng và pháttriển của lan Hoàng thảo phi điệp tím (Dendrobium anosmum Lindl.) sau khira cây trồng trong bầu.Đề tài được thực hiện tại phòng thí nghiệm sinh học thuộc Khoa Khoahọc Sự sống, trường Đại học Khoa học, Đại học Thái Nguyên.
4đến một kích thước nào đó sẽ phát triển thêm lá và rễ tạo nên một thân cây.Thân cây cứ phát triển theo cách này tạo nên một tập hợp phân nhánh cácthân cây mọc từ cây gốc ban đầu gọi là cây đa thân, ví dụ như chi lanCattleya, Dendrobium…[4], [17].Dựa theo khả năng thích nghi với điều kiện môi trường họ lan đượcchia thành 4 nhóm chính:Phong lan (Epiphyte): Là loài sống ký gửi nhờ vào thân cây cao ẩmmục ở trong rừng hoặc trên núi cao, rễ bám vào các cây to, thân rủ xuống.Địa lan (Terrestrial): Là loài có thân giả dạng củ, rễ chùm sống nhờđất ở sườn núi, bờ suối hay dưới tán rừng ẩm ướt. Địa lan có nhiều loài vớihình dáng, màu sắc phong phú đẹp mắt.Hoại lan (Saprophyte): Gồm những loại mọc trên rêu và gỗ mục.Thạch lan (Lithophyte): Gồm một số loại mọc trên đá.1.1.1. Chi lan Hoàng thảo (Dendrobium)1.1.1.1. Phân loại chi lan Hoàng thảoChi lan Hoàng thảo (Dendrobium) là chi lan lớn thứ 2 trong họ hoa lanđứng sau lan lọng. Lan Hoàng thảo rất phong phú và đa dạng với hơn 1600loài, phân bố ở các vùng Châu Úc, Châu Á tập trung nhiều nhất ở Đông NamÁ. Lan Hoàng thảo rất đa dạng về cấu tạo sinh học, hình thái và phong phú vềdạng cây, dạng hoa. Vì vậy các nhà khoa học đã chia thành 40 nhóm nhỏ đểtiện cho việc nghiên cứu và trồng trọt. Trong đó tiêu biểu nhất là các nhóm:Nhóm thứ nhất có đặc điểm là lá xanh quanh năm, hoa thường mọc ởgần ngọn có nhiều màu sắc sặc sỡ như: Dendrobium bigibbum, Dendrobiumphalaenopsis…[17]Nhóm thứ hai có đặc điểm là các giả hành buông thõng xuống, mangnhiều lá xanh hai bên, hoa mọc thành từng chùm hoặc từng hoa như:Dendrobium anosmum, Dendrobium aphyllum…Nhóm thứ ba có đặc điểm là hoa mọc ở đỉnh, buông thõng xuống và có
5mùi thơm như: Dendrobium farmeri, Dendrobium chrysotoxum…Nhóm thứ tư có đặc điểm là chùm hoa mọc thẳng đứng, màu xanh hoặcmàu vàng như: Dendrobium atroviolaceum, Dendrobium spetabile…Nhóm thứ năm có đặc điểm là giả hành mọc thẳng đứng có một lớplông bao phủ như: Dendrobium draconis, Dendrobium formosum…[17]Bên cạnh đó, có thể căn cứ vào đặc điểm sinh trưởng và dạng thân, lanDendrobium được chia thành 2 nhóm chính:Nhóm thân mềm: Có đặc điểm là các giả hành buông lõng hoặc rủxuống, thường thấy ở vùng khí hậu lạnh, gồm các giống được lấy ở vùng caonguyên Việt Nam, Miến Điện…, trên độ cao 1000 m.Nhóm thân cứng: Mọc thẳng đứng thường ở vùng nóng hơn (Malaysia,Indonexia…).Ngoài ra còn một nhóm Dendrobium trung gian có thể sống ở cả vùngnóng lạnh như: Dendrobium primulimun, Dendrobium farmeri… [17].1.1.1.2. Các điều kiện cơ bản để nuôi trồng lan DendrobiumÁnh sáng: Lan cần nhiều ánh sáng gần như có thể để ở ngoài trờinhưng cần phải có lưới che phòng khi lá non bị cháy nắng. Khi thấy cây quặtquẹo, đó là dấu hiệu thiếu nắng, nếu thiếu nắng cây khó ra hoa.Nhiệt độ: Lan cần nuôi trong nhiệt độ từ 8 – 25°C tuy nhiên lan có thểchịu nóng tới 38°C và có thể chịu lạnh tới 3,3°C. Ngoài ra nếu vào mùa đônglạnh dưới 15,6°C trong vòng 4 – 6 tuần lan sẽ khó ra nụ.Độ ẩm và thoáng gió: Lan mọc mạnh nếu độ ẩm từ 60 – 70%. Nếu độẩm quá thấp cây non sẽ không lớn được và bị teo đi. Cây cũng không mọcmạnh nếu không thoáng gió và trong thời kỳ lan ra nụ nếu không thoáng giónụ sẽ ít đi.Giá thể: Với một số loài lan trồng không cần dùng đến giá thể vẫn sinhtrưởng tốt, nhưng nếu môi trường sống có giá thể vẫn tốt hơn. Giá thể của langồm những thứ dễ kiếm, có sẵn trong tự nhiên. Những chất liệu này không
6phải vùng nào cũng giống nhau và chúng được chọn tùy theo điều kiện ngoạicảnh, nhân lực, loài lan và quy mô sản xuất. Những loại giá thể thường sửdụng như vỏ thông, vỏ dừa, rêu…Tưới nước: Vào mùa hè khi lan ra mầm non và mọc mạnh, tưới 2 – 3lần một tuần. Vào mùa thu, khi cây đã ngừng tăng trưởng nên tưới nước thưađi, mỗi tuần chỉ cần tưới 1 lần cho thân cây khỏi bị teo lại. Vào mùa đông,đây là thời gian lan chuẩn bị để ra hoa, ngưng hẳn việc tưới nước. Nếu độ ẩmquá thấp nên phun sương mỗi tháng 1 – 2 lần [19].1.1.1.3. Sâu bệnh và các vấn đề khácVì lan Dendrobium cần được bón nhiều loại phân hữu cơ khác nhau vàmôi trường giá thể sẽ mục nát sau một thời gian trồng cây nên đã tạo điều kiệncho nhiều loài sâu bệnh gây hại, một số bệnh thường gặp và cách điều trị:Bệnh đen thân cây lan: Do nấm Fusarium gây nên, cách phòng trị làtách những cây bị bệnh để riêng và dùng thuốc phòng trừ hay nhúng cả câyvào thuốc trị nấm. Với cây lớn hơn thì cắt bỏ phần thối rồi phun thuốc diệtnấm như Carboxin 1/2000; Zineb 3/2000; Benlat 1/2000 [18].Bệnh đốm lá: Do nấm Cercospora gây nên, bệnh thường phát sinhmạnh trên cây lan Dendrobium, gây hại trong mùa mưa ở những vườn lan cóđộ ẩm cao, phòng trừ bằng các thuốc diệt nấm như Carboxin 1/2000; Zineb3/2000; Benlat 1/2000 [18].Bệnh thán thư: Do nấm Collectotrichicum gây ra. Bệnh phát triển mạnhvào mùa mưa nên phải phòng trừ trước, thường cắt bỏ lá vàng rồi phun thuốcdiệt nấm 5 – 7 ngày/lần [18].Bệnh thối mềm vi khuẩn: Do vi khuẩn Pseudomonas gladioli gây ra.Vết bệnh có hình dạng bất định, ủng nước, màu trắng đục, thường lan rộngtheo chiều rộng của lá. Gặp thời tiết ẩm ướt mô bệnh bị thối úng, thời tiết khôhanh mô bệnh khô tóp có màu trắng xám [18].Để phòng trừ bệnh do nấm, trước hết cần bảo đảm cho cây đủ dinhdưỡng và tỷ lệ N:P:K cân đối. Dư N và thiếu K thường làm cho lá mềm, dễ
7nhiễm bệnh. Ánh sáng phải đầy đủ để giữ độ cứng cho lá. Lá bị gãy do dư N,thiếu K hay do thiếu ánh sáng. Không tưới dư nước vì dễ làm cho rễ úng vàthối. Phun thuốc phòng ngừa thường xuyên 1 tháng 1 – 2 lần. Nếu thấy bệnhxuất hiện cần phun nhiều hơn (2 – 3 lần/tuần) cho đến khi triệu chứng bệnhgiảm thì trở lại phun theo cách phòng ngừa [18].Sâu hại lan: Rệp vảy thường bám trên các thân giả hành còn non,phòng trị bằng cách dùng bàn chải chà xát rồi phun dung dịch thuốcMalathion 50 pha loãng; Bọ trĩ gây hại chủ yếu trong mùa nắng, dùngMalathion 5 mg/bình 4 lít nước, phun 1lần / tuần, phun liên tiếp liên tục trong3 tuần [19] .1.1.2. Lan Hoàng thảo phi điệp tím (Dendrobium anosmum Lindl.)1.1.2.1. Phân loạiCó nhiều cách phân loại cho Hoàng thảo phi điệp tím, theo hệ thốngAPG III thì lan được phân loại như sau:Giới: Thực vật (Plantae)Ngành: Thực vật hạt kín (Angiospermae)Lớp: Một lá mầm (Monocotylendons)Bộ: Măng tây (Asparagales)Họ: Phong lan (Orchidaceae)Phân họ: Lan biểu sinh (Epidendroideae)Chi: Hoàng thảo (Dendrobium)Loài: Phi điệp tím (Dendrobium anosmum Lindl.)Tên khoa học của lan Hoàng thảo phi điệp tím được nhiều nhà khoahọc công nhận là Dendrobium anosmum Lindl.[3].1.1.2.2. Đặc điểm sinh học– Rễ của Hoàng thảo phi điệp tím thuộc loại rễ bì sinh, xung quanh rễthật được bao bọc bởi một lớp mô xốp giúp cây dễ dàng hút nước, muối
8khoáng và ngăn chặn ánh sáng mặt trời gay gắt. Chóp rễ có màu xanh lá cây,ở phần rễ có các sắc lạp không bị ngăn bởi mô xốp nên có thể giúp câyquang hợp.– Thân của Hoàng thảo phi điệp tím thuộc nhóm lan thân có giả hành.Giả hành chứa diệp lục, dự trữ nước và chất dinh dưỡng cần thiết cho sự pháttriển của giả hành mới. Cấu tạo của giả hành gồm nhiều mô mềm chứa đầydịch nhầy, phía ngoài có lớp biểu bì với vách tế bào dày, nhẵn bóng bảo vệ đểtránh sự mất nước do mặt trời hun nóng. Củ giả hành có màu xanh bóng nêncùng với lá nó cũng làm nhiệm vụ quang hợp [4].– Lá là cơ quan dinh dưỡng của hoa lan, là xưởng chế tạo chất dinhdưỡng bằng quang hợp. Xếp thành hai dãy đối nhau trên thân (lá đối), lá cóhình xoang, các gân lá chính chạy song song và các khe lõm xuống, lá rụngtạo thành các giả hành.– Hoa không những mọc trên những giả hành mới mà còn mọc trên cácgiả hành cũ. Trên cánh có phủ lông mịn và có ánh kim, trên lưỡi thường cóhai mặt tím đậm, hương thơm ngào ngạt. Bên trong hoa có cột nhị nhụy nằmchính giữa hoa mang phần đực ở phía trên và phần cái ở phía trước mặt. Nhịgồm hai phần bao phấn và hốc phấn. Bao phấn nằm ở cột nhị nhụy còn hốcphấn thì lõm lại mang khối phấn và thường song song với bao phấn. Khốiphấn gồm toàn bộ hạt phấn dính lại với nhau, rất cứng.– Quả của Hoàng thảo phi điệp tím thuộc loại quả nang nở ra theo 3 – 6đường nứt dọc, khi chín quả nở ra, mảnh vỏ còn dính lại với nhau ở phía đỉnhvà phía gốc. Bên trong chứa rất nhiều hạt, khi chín hạt có màu vàng. Hạt cấutạo bởi một phôi chưa phân hóa, trên một máng lưới nhỏ, xốp chứa đầy khôngkhí. Hạt rất nhiều và nhỏ, toàn bộ hạt trong một quả nặng chỉ bằng một phầnmười mg, rất nhẹ nên dễ phát tán nhờ gió [4], [5].1.1.2.3. Phân bốHoàng thảo phi điệp tím có nguồn gốc rộng lớn khắp châu Á, từ miềnNam Nhật Bản đến các chân đồi phía Himalaya, bán đảo Đông Dương,
9Malaysia, Indonexia… Ở Việt Nam, loài này phân bố trên khắp các núi rừngtừ Bắc tới Nam: Đô Lương, Đà Lạt, Đắk Lắc, Hòa Bình… [16].
Hình 1.1. Hoa và cây phong lan Hoàng thảo phi điệp tím1.1.3. Các phương pháp nhân giống trên cây lan1.1.3.1. Các phương pháp nhân giống truyền thốngNhân giống vô tínhTách bụi: Phương pháp này dùng để tách các chậu lan quá đầy, đồngthời làm tăng số lượng cây mới. Các giả hành già được tách ra khi hoa đã tànvà chỉ tách khi đã trồng được từ 2 – 3 năm. Giả hành già được ươm lại trên giáthể ẩm để tạo chồi con, các chồi con được nuôi cùng với giả hành cho đến lúcđã tạo ra rễ mới, đủ sức phát triển mới tách lần thứ hai, từ một giả hành có thểcho mỗi đợt 1 – 2 cây con [5].Chiết cành: Ở Dendrobium thường tạo ra cây con trên giả hành mộtcách tự nhiên. Khi các cây con phát triển khá mạnh, có rễ tốt có thể tách rakhỏi giả hành để trồng. Phương pháp chiết tách đảm bảo được tính chất ditruyền của cây bố mẹ nhưng lại cho một thế hệ cây con sinh trưởng khôngđồng đều nên khó cung cấp một số lượng cây con lớn để phục vụ cho nuôitrồng với quy mô lớn.
10Nhân giống hữu tính: Trong thiên nhiên sự thụ phấn ở lan do côntrùng thực hiện do cấu trúc của hoa lan là hoàn toàn để thích nghi cho sự thụphấn ấy. Có 2 phương pháp thụ phấn:Sự tự thụ phấn: Khi phấn hoa của bông hoa này được rơi trên númnhụy của chính hoa ấy. Điều này hiếm khi xảy ra trong tự nhiên ở hoa lan vìcấu trúc của bộ phận sinh dục đực và cái ở hoa lan.Sự thụ phấn chéo: Khi phấn hoa ở hoa này rơi vào núm nhụy của hoahác của cùng một cây hay cùng loài hoặc khác loài, khác giống.Nếu sự thụ phấn có kết quả thì có thể ngay trong ngày hay sang ngàyhôm sau, các phiến hoa co lại nhưng không rụng và để tránh sự thụ phấn khácdo côn trùng người ta dùng bao nilon trùm lại nhưng không buộc kín miệng vìhầm hơi sẽ làm hư trái. Sau khi thụ phấn, bầu noãn từ từ trương, phình to rathành trái, mỗi trái có thể chứa hàng ngàn đến triệu hạt. Khi trái từ màu xanhlục chuyển sang màu vàng lục thì nên hái trái.Trong thiên nhiên muốn hạt lan nảy mầm được thì hạt lan phải đượcnhiễm một số loại nấm cộng sinh. Người ta đã khám phá ra một số loài nấmgiúp hạt lan nảy mầm, mỗi loài chỉ giúp nảy mầm ở một số giống lan như:Rhizoctonia repens giúp nảy mầm Cattleya, Cypripedium, Dendrobium;Rhizoctonia mucoroudes giúp nảy mầm Vanda, Phalaenopsis; Rhizoctonialanugiosa giúp cho hạt nảy mầm ở Oncidium [3].Nhân giống in vitroNgày nay với công nghệ nhân giống in vitro, từ một quả lan có thể tạora từ vài nghìn đến hàng triệu cây con ổn định về mặt di truyền, đồng thời cóchất lượng tốt và đáp ứng nhu cầu ngày càng cao của thị trường.1.2. Sơ lƣợc về nuôi cấy mô tế bào thực vật1.2.1. Các hướng nghiên cứu ứng dụng và ưu thế của kĩ thuật nuôi cấy mô– tế bàoNhân giống in vitro là một trong những ứng dụng chính của công nghệtế bào thực vật, sử dụng môi trường nhân tạo để nhân đỉnh sinh trưởng hoặccác mô phân sinh trong cây[1].
11Mục đích của kĩ thuật nhân nhanh giống đó là: (1) Duy trì và nhânnhanh các kiểu gen quý làm vật liệu cho công tác chọn giống; (2) Duy trì vànhân nhanh các cá thể đầu dòng tốt để cung cấp hạt giống các cây trồng khácnhau; (3) Nhân nhanh với điều kiện vô trùng cách ly tái nhiễm kết hợp vớiviệc làm sạch bệnh cho cây; (4) Rút ngắn thời gian đưa các cây lai và các loàitự nhiên có đặc điểm tốt vào sản xuất hoặc nhân nhanh bố mẹ của các cặp laitrong sản xuất; (5) Bảo quản tốt tập đoàn giống vô tính về các loài cây giaophấn trong ngân hàng gen [1].Vì vậy, nuôi cấy mô – tế bào đã mang lại hiệu quả hết sức to lớn nhờ cócác ưu thế, đó là: (1) Hệ số nhân giống cao rút ngắn thời gian đưa con giống vàosản xuất. Trong phần lớn các trường hợp công nghệ nuôi cấy mô tế bào đảm bảotốc độ nhân nhanh, từ một cây trong vòng 1 – 2 năm có thể tạo thành hàng triệucây; (2) Nhân được một số lượng cây lớn trong một diện tích nhỏ; (3) Làm sạchbệnh cây trồng và cách ly chúng với các nguồn bệnh; (4) Thuận tiện việc vậnchuyển và bảo quản; (5) Sản xuất quanh năm, quy trình sản xuất có thể được vậnhành trong bất cứ thời gian nào trong ngày, mùa nào trong năm.1.2.2. Các phương thức nuôi cấy mô tế bào trong nhân giống vô tínhNuôi cấy mô phân sinh hoặc đỉnh sinh trưởng: Ở lan có sự phát triểncùng một lúc đỉnh sinh trưởng tạo hàng loạt protocrom sau đó tiếp tục phânchia cho ra các protocrom mới hay các chồi mới tạo thành cây hoàn chỉnh.Tái sinh cây hoàn chỉnh từ các bộ phận khác của cây: Ngoài mô phânsinh và đỉnh sinh trưởng là bộ phận dễ nuôi cấy thành công, các bộ phận còn lạicủa một cơ thể thực vật đều có thể ứng dụng cho nuôi cấy mô – tế bào như cácđoạn thân, cuống lá, các bộ phận của hoa, nhánh củ…Nhân giống qua giai đoạn mô sẹo: Trong khuôn khổ mục đích nhângiống vô tính, nếu tái sinh được cây hoàn chỉnh trực tiếp từ mẫu cấy ban đầu thìkhông những nhanh chóng thu được cây mà các cây cũng khá đồng nhất về mặtdi truyền.
121.2.3. Các giai đoạn của nhân giống in vitroGiai đoạn 1: Khử trùng mô nuôi cấyĐây là giai đoạn tối quan trọng quyết định toàn bộ quá trình nhân giốngin vitro. Mục đích của giai đoạn này là phải tạo ra được nguyên liệu vô trùngđể đưa vào nuôi cấy in vitro [1], [11].Giai đoạn 2: Tái sinh mẫu nuôi cấyMục đích của giai đoạn này là tái sinh một cách định hướng các mônuôi cấy. Quá trình này được điều khiển chủ yếu dựa vào tỉ lệ của các hợpchất auxin, cytokynin ngoại sinh đưa vào môi trường nuôi cấy [1], [11].Giai đoạn 3: Nhân nhanhGiai đoạn này được coi là giai đoạn then chốt của quá trình. Để tăng hệsố nhân, ta thường đưa thêm vào môi trường dinh dưỡng nhân tạo các chấtđiều hoà sinh trưởng (auxin, cytokynin, gibberellin…), các chất bổ sung khácnhư nước dừa, dịch chiết nấm men,… kết hợp với các yếu tố nhiệt độ, ánhsáng thích hợp [1], [11].Giai đoạn 4: Tạo cây hoàn chỉnhKhi đạt được kích thước nhất định, các chồi được chuyển từ môi trườngở giai đoạn 3 sang môi trường tạo rễ. Thường 2 – 3 tuần, từ những chồi riêngl này sẽ xuất hiện rễ và trở thành cây hoàn chỉnh. Ở giai đoạn này người tathường bổ sung vào môi trường nuôi cấy các auxin là nhóm hormon thực vậtquan trọng có chức năng tạo rễ phụ từ mô nuôi cấy [1], [11].Giai đoạn 5: Đưa cây ra giá thểGiai đoạn đưa cây hoàn chỉnh từ ống nghiệm ra ngoài môi trường lbước cuối cùng của quá trình nhân giống in vitro và là bước quyết định khảnăng ứng dụng quá trình này trong thực tiễn sản xuất. Đây là giai đoạnchuyển cây con in vitro từ trạng thái sống dị dưỡng sang sống hoàn toàn tựdưỡng, do đó phải đảm bảo các điều kiện ngoại cảnh phù hợp để cây con đạttỉ lệ sống cao trong vườn ươm cũng như ruộng sản xuất [1], [11].
131.2.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy môMô nuôi cấy:Mỗi tế bào ở mỗi mô khác nhau có khả năng tạo mô sẹo, phân hóathành rễ, thân, cành, lá… rất khác nhau. Việc chọn mẫu thực vật để sử dụngtrong quá trình nuôi cấy có vai trò quyết định nếu chọn sai mẫu chúng ta sẽkhông thu nhận được kết quả hoặc thu được những cây sẽ không phát triểnmạnh, thậm chí cây có thể ngừng phát triển ở một giai đoạn nhất định.Điều kiện vô trùng:Môi trường nuôi cấy mô thực vật có các thành phần thích hợp cho cácloại nấm, vi khuẩn phát triển. Vì vậy, điều kiện tiên quyết là phải đảm bảonguyên tắc vô trùng cho mẫu cấy, môi trường cấy và các trang thiết bị liênquan trong suốt quá trình nuôi cấy, tất cả các thao tác nuôi cấy, cấy chuyển…cũng phải thực hiện trong điều kiệ
1].
Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng:Nguồn cacbon: Nguồ
đường sucrose,
glucose, maltose, galactose. Cung cấp năng lượng cho nuôi cấy đồng thờiđóng vai trò duy trì áp suất thẩm thấu của môi trường [1], [10].Thành phần khoáng: Các nguyên tố đa lượng như: N, P, S, K, Mg,Ca… được sử dụng ở nồng độ trên 30 mg/l và thường tồn tại dưới các dạngmuối NH4+, NaH2PO4, KNO3, KCl… Các nguyên tố vi lượng như: Mn, Bo,Zn, Cu, Ni… được cung cấp với hàm lượng nhỏ hơn 30 mg/l [1], [10].Vitamin: Để cây phát triển được tối ưu ta cần bổ sung từ bên ngoài cácvitamin như: Vitamin B1, B2; myo-inositol; biotin; pantothenic acid…Nước: Nước là thành phần quan trọ
ấy, nó
chiếm khoảng 95% trong môi trường dinh dưỡng.Agar: Hàm lượng agar thường dùng cho môi trường nuôi cấy dao độngtừ 0,6 – 1,0% theo khối lượng.Than hoạt tính: Nồng độ sử dụng thường là từ 0,2 – 3%. Than hoạ
14hấp thụ độc tố nâu/đen và các độc tố không màu khác; hấp thụcác hợp chất hữu cơ khác (auxin, cytokinin, ethylene, vitamin…); thúc đẩy sựtạo phôi soma, ổn định độ pH [1], [10].Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật:Là thành phần không thể thiếu trong môi trường nuôi cấy, có vai tròquan trọng trong quá trình phát sinh hình thái thực vật in vitro. Hiệu quả tácđộng của chất điều hoà sinh trưởng phụ thuộc vào: nồng độ sử dụng, hoạt tínhvốn có của chúng và nguồn gốc mô cấy…Chất điều hoà sinh trưởng (phytohormon) được chia làm hai nhóm chấtcó tác dụng đối kháng về sinh lý đó là: nhóm chất kích thích sinh trưởng vànhóm chất ức chế sinh trưởng. Đối với nhóm chất kích thích sinh trưởng gồmcó 3 nhóm chính đó là: auxin, gibberellin và cytokinin được sử dụng chủ yếutrong nuôi cấy. Còn các chất thuộc nhóm ức chế sinh trưởng gồm có ABA,etilen, các hợp chất phenol, các chất ức chế tổng hợp như retardant, các chấtdiệt cỏ… Bên cạnh các chất điều hoà sinh trưởng, người ta còn bổ sung thêmcác dung dịch hữu cơ có thành phần phức tạp và không xác định như: dịchchiết nấm men, nước ép khoai tây, chuối, nước dừa, cazein thuỷ phân… nhằmtăng cường sự sinh trưởng và phát triển của mô cấy [10].Ảnh hƣởng củ
ật lí:
Nhiệt độ thông thường trong phòng thí nghiệm nhiệt độ được duy trìbằng máy điều hoà ở 25 ± 2 C phù hợp với đa số mô cấy; ánh sáng có ảnhhưởng mạnh tới quá trình phát sinh hình thái của mô nuôi cấy bao gồm cườngđộ, chu kỳ và thành phần quang phổ ánh sáng (Read, 1990; Dooley, 1991).Cường độ ánh sáng trắng từ 1000 – 2500 lux, với chu kỳ 16/24 giờ chiếu sángđược dùng phổ biến cho nhiều mô nuôi cấy; pH của môi trường nuôi cấythường ở khoảng 5,8 – 6 thì tốt trong nuôi cấy mô [10].1.3. Một số nghiên cứu nhân giống in vitro lan DendrobiumPhong lan là một trong những loại cây trồng có nhiều thành công nhất
15trong nhân giống vô tính bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào. Trên thế giớicũng như tại Việt Nam đã có rất nhiều công trình về nhân nhanh các giống lannhằm bảo tồn và tăng số lượng phục vụ sản xuất. Với việc sử dụng kĩ thuậtnhân giống đã tạo ra sự phát triển vượt bậc nghề trồng lan ở quy mô lớn.1.3.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giớiTháng 8/2010, Maridass M. và cộng sự đã tiến hành nhân giống in vitrophong lan Dendrobium nanum từ nguồn vật liệu ban đầu là thân rễ. Nghiêncứu này được đăng trên Tạp chí Công nghệ sinh học quốc tế (2010). Vật liệuthân rễ được rửa bằng nước cất, rửa qua ethanol 70% trong 30 giây, tiếp theokhử trùng với hyponatri 3% (bổ sung 2 – 3 giọt Tween80 EAC) trong 20 phútvà sau đó rửa sạch cho 4 – 5 lần bằng nước cất vô trùng. Thân rễ được chẻ racắt miếng nhỏ (5 mm) và các mảnh rễ được cấy trên môi trường cơ bản củaMS bổ sung các chất KTST như NAA, BAP và kinetin. Các mẫu hình thànhprotocorm tốt trên môi trường MS + kinetin 1,2μM + NAA 2.0μM. Sau đóprotocorm phát sinh chồi tốt nhất trên môi trường MS + BAP 0.5μM [14].Năm 2011, Sana A. và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu nhân nhanhchồi giống lan Dendrobium nobile var. Emma từ chồi nách, sử dụng môitrường có bổ sung BAP ở các nồng độ khác nhau 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5 và 3,0mg/l và kinetin. Qua nghiên cứu các tác giả nhận thấy ở môi trường có chứaBAP 1,5 mg/l kết hợp với kinetin cho kết quả nhân chồi cao nhất. Tạo câyhoàn chỉnh tốt nhất trên môi trường chứa IBA 2 mg/l với tỷ lệ phần trăm tạorễ (97,5%), số lượng rễ (4,70) và chiều dài cây (3,47 cm) hiệu quả hơn so vớiNAA. Nồng độ cao hơn của IBA và NAA (3,0 mg/l) cho thấy khả năng hìnhthành rễ kém [15].Bijaya P. và Deepa T. (2012) khi nghiên cứu nhân nhanh giốngDendrobium primulinum Lindl. đã nhận thấy: Thông qua việc nuôi cấy cácđỉnh chồi có kích thước từ 0,3 đến 0,5 mm trên môi trường MS cơ bản và môitrường MS bổ sung kết hợp các chất NAA, BAP ở các nồng độ khác nhau,
16các protocorm hình thành đã tạo chồi và rễ. Sau 5 tuần nuôi cấy số lượng chồităng nhanh nhất trên môi trường MS + BAP 1,5 mg/l + NAA 0,5 mg/l. Trongthí nghiệm tạo rễ, rễ được quan sát sau 3 tuần cấy thấy trên môi trường MS +IAA 0,5 mg/l, cây lan ra rễ tốt nhất. Khi ra cây trên giá thể đất sạch và rêu(dớn) tỷ lệ 2:1 thì gần 70% cây con sống sót [13].1.3.2. Tình hình nghiên cứu tại Việt NamPhong lan Việt Nam có số lượng chi và loài phong phú, dần trở thànhmột họ cây có giá trị tài nguyên và kinh tế bậc nhất trong các họ cây rừng.Việt Nam trong những năm gần đây đã có rất nhiều đề tài nhân giống phonglan đặc biệt là các cây lan có giá trị như các nghiên cứu:Bùi Thị Tường Thu và cộng sự (2007), khi nghiên cứu sự ảnh hưởngcủa chất điều hòa sinh trưởng đến quá trình phát sinh phôi và tế bào đã đưa ramột số kết quả về lan Dendrobium như sau: Mẫu nuôi cấy ban đầu là chồinon, được cắt thành lát mỏng, nuôi cấy trên môi trường VW + saccharose 20g/l + nước dừa 100 ml/l + peptone 1 g/l + BA 1 mg/l + NAA 0,3 mg/l + AC 1g/l. Sau thời gian nuôi cấy 30 ngày, tế bào soma phát sinh trên vết cắt, tỷ lệtạo soma là 100% trên các mẫu nuôi cấy. Tế bào soma màu trắng sáng, đượctiến hành nhân sinh khối trên 6 môi trường thực nghiệm và kết quả thu đượctế bào soma tăng sinh mạnh mẽ trên môi trường VW + BA 1 mg/l + NAA 0,3mg/l + nước dừa 100 ml/l [8].Nguyễn Thanh Tùng và cộng sự (2010) đã áp dụng phương pháp nuôicấy lát mỏng tế bào trong nhân giống in vitro cây Hoàng thảo thân gãy(Dendrobium aduncum). Trong nghiên cứu của nhóm tác giả này, vật liệukhởi đầu là chồi in vitro được cắt lát mỏng theo chiều ngang. Kết quả chothấy mẫu cảm ứng tốt trên môi trường ½ MS + BA 0,5 mg/l và tái sinh tốttrên môi trường MS + kinetin 3 mg/l + NAA 0,3 mg/l. Từ protocorm tỷ lệchồi đạt được 5,67 chồi/mẫu [9].Nghiên cứu nhân nhanh in vitro giống lan Hoàng thảo phi điệp tím