1. Nhân giống hoa lan (phong lan, địa lan) bằng phương pháp gieo hạt
Trong thực tế hoa lan ít khi nhân giống hữu tính, bởi vì hạt của lan rất nhỏ, kỹ thuật gieo ươm phức tạp, tỷ lệ nẩy mầm thấp và tính phân ly lớn khi trồng bằng hạt, khó duy trì được đặc tính tốt của cây mẹ. Nhưng cũng chính vì mang tính di truyền phức tạp, phân ly lớn cho nên là cơ hội tốt cho các nhà tạo giống và đông đảo người trồng hoa lan tuyển chọn được những giống lan quý. Bởi vậy nhân giống bằng hạt cũng là một trong những khâu quan trọng trong tạo giống lan.
1.1. Các phương pháp nhân giống hoa lan (phong lan, địa lan) bằng gieo hạt
Có hai cách nhân giống lan bằng hạt là vô khuẩn và hữu khuẩn
– Phương pháp hữu khuẩn là đem hạt gieo vào giá thể của rễ lan trồng trong chậu, trước khi gieo hạt phủ rêu lên mặt chậu rồi hãy gieo hạt lên trên. Hạt giống sẽ nẩy mầm nhờ sức tác của thực khuẩn của rễ hoặc lấy thực khuẩn từ rễ cây lan đem trộn với hạt rồi đem gieo thẳng xuống giá thể. Nhưng dù là phương pháp nào đi nữa thì tỷ lệ nẩy mầm rất thấp.
– Phương pháp gieo hạt vô khuẩn được tổ nghiên cứu Gasmolin phát hiện từ những năm 20-30 của thế kỷ 20, bằng cách sử dụng dung dịch dinh dưỡng vô cơ, có thể làm cho hạt nẩy mầm và chứng minh kỹ thuật nhân giống hiệu quả cao được xác lập trên cơ sở trong điều kiện vô khuẩn. Cây giống mọc từ hạt có thể sinh trưởng khỏe mạnh cho đến khi ra hoa, đã được các nước trên thế giới ứng dụng rộng rãi.
1.2. Môi trường gieo hạt hoa lan
Chất dinh dưỡng cây trồng dùng cho gieo hạt vô khẩn được phối chế theo môi trường MS (Muzashig and Skoog, 1962) hoặc KC (Kunsun C, 1946) nhưng tùy giống, loài mà tăng thêm than và nước dừa.
1.3. Diệt khuẩn khử trùng hạt giống hoa lan
Hái lấy quả sắp chín (80-90%) hoặc chưa chín, dùng bông tẩm cồn lau sạch bề ngoài, dùng dao tách quả để lấy hạt, dùng vải trắng gói lại, làm ướt bằng nước vô trùng, dùng giấy lọc thấm nước, đưa vào ngâm 5-10 phút đầu trong dung kịch KOH, vớt ra rửa sạch bằng nước vô trùng 3 lần, dùng giấy lọc thấm hết nước lại đưa vào ngâm trong dung dịch nước tẩy trùng (H 2O 2, HgCl…) để diệt khuẩn 10-20 phút rồi vớt ra rửa bằng nước vô trùng vài lần là có thể dùng được.
1.4. Nuôi dưỡng gieo hạt vô trùng
Dùng que bạch kim, ống hút hoặc bơm tiêm hút lấy hạt đã qua xử lý trên bàn siêu sạch, gieo vào bình hoặc ống nghiệm, dán nhãn sau đó đưa vào phòng cấy mô nơi có ánh sáng tán xạ với nhiệt độ 20-260C. Sau khi phôi lớn cho chiếu sáng 2.000 – 3.000 Lux mỗi ngày 10-18 tiếng. Lượng giống trong bình sao cho các hạt giống đều được tiếp xúc với dung dịch là được. Hạt giống được phân đều trên bề mặt của dung dịch, không được chùm xuống dưới để tránh bị ngạt, thời gian nẩy mầm của hạt tùy theo giống. Khi nẩy mầm phôi phình to, mầu vàng nhạt, rồi dần dần chuyển sang màu xanh vàng cho đến màu xanh và từ phôi xuất hiện thân hình cầu, từ thân hình cầu mọc thành mầm. Sau khi gieo hạt 1-2 tuần phôi phình to, 4-6 tuần hạt có màu xanh chứng tỏ diệp lục đã có trong phôi. Lá đầu tiên xuất hiện chính giữa đỉnh thân hình cầu. Sau khi gieo 2-3 tháng xuất hiện lá thứ 2-3 thân hình cầu dài ra và có sợi rễ đầu tiên. Có những giống khó mọc rễ cần thay dung dịch với liều lượng và chủng loại khác nhau, cho đến khi cây mọc vài cái rẽ và lá mọc đều hãy đưa cây trồng vào giá thể. Những cây sinh trưởng yếu cần chuyển vào vị trí của những cây sinh trưởng khỏe tiếp tục nuôi dưỡng.
1.5. Lấy cây thực sinh trong ống nghiệm
Đây là khâu rất quan trọng, nếu thao tác không cẩn thận hoặc không chu đáo có thể bị chết do không thích nghi với môi trường bên ngoài hoặc phí công của các công đoạn trước. Trước khi lấy cây nên rời đến những nơi có môi trường tương tự để nó thích ứng với môi trường tự nhiên và nhiệt độ trong phòng, khi cần thiết có thể bỏ nắp đậy 2-3 ngày, tiếp đó lấy cây từ trong bình ra rửa sạch dung dịch dính vào cây, chú ý tránh tổn thương đến rễ, sau đó đem ngâm vào thuốc tím từ 5-10 phút, vớt lên đặt lên mặt báo cho ráo nước, cuối cùng đem cây trồng vào giá thể (hỗn hợp giữa than bùn, rêu, bã mía… với cát mịn). Đầu tiên nên đặt cây ở chỗ ẩm độ cao, ánh sáng yếu 6-7 ngày sau đó hãy chuyển vào phòng có nhiệt độ 250C và độ ẩm tương đối cao và ánh sáng tán xạ khá mạnh cho đến khi cây sống, mỗi ngày phun nước 1 lần và phun thuốc diệt khuẩn theo định kỳ, sau một tháng mới đem trồng vào nơi có ánh sáng tương đối. Tùy thuộc vào độ lớn của cây mà thay chậu, thường thường sau hai năm sẽ ra hoa.
Hiện nay trên thế giới đã sử dụng phương pháp gieo hạt quả xanh:
Thường sau khi thụ tinh, một cây lan cần thời gian từ 6 tháng đến 1 năm để quả chín. Tuổi thành thục của địa lan ngắn hơn phong lan. Ví dụ loài Aspasia principissa là 400 ngày. Ngoài ra để đảm bảo sự thành công tạo cây con lai bằng kỹ thuật lai giống từ 2 loài lan có nhiễm sắc thể khác nhau người ta đã dùng phương pháp gieo hạt hoàn toàn mới đó là phương pháp gieo hạt xanh.
Phương pháp gieo hạt xanh được thực hiện trong phòng thí nghiệm tương tự phương pháp nảy mầm không cộng sinh nấm, nhưng có lợi và sử dụng hạt còn xanh nên những hạt bên trong không bị nhiễm các mầm bệnh như quả chín. Ngoài ra vỏ quả có thể được khử trùng với một dung dịch có cường độ mạnh nhưng hạt bên trong vẫn không bị ảnh hưởng. Vỏ quả đã tách ra bằng một dụng cụ đã khử trùng trong tủ cây vô trùng, lúc này hạt được gieo trực tiếp mà không phải khử trùng lần nữa.
Thời gian thu hoạch quả xanh của một số loài, sau khi hạt được hình thành như sau:
– Cattleya 2 lá: 90 ngày
– Cattleya 1 lá: 120-135 ngày
– Dendrobium nobile lai: 90-100 ngày
– Các loại Dendrobium khác: 60-75 ngày
– Oncidium: 60-75 ngày
– Phalaenopsis: 90-100 ngày
– Vanda: 90-120 ngày
Những điều cần lưu ý khi gieo hạt xanh
– Cần gieo ngay hạt khi đã lấy ra khỏi quả, hạt lan không để lâu được vì dễ mất sức nẩy mầm.
– Cần rải hạt lan đều trên môi trường gieo hạt, hạt dày quá, cây con lên sẽ yếu. Nếu các hạt lan dính nhau trong ống nghiệm mà lắc không ra có thể cho vào 1 giọt aerosol để tách các hạt lan ra.
Khi gieo hạt xong, cần đặt bình cấy vào môi trường mát mẻ, nhiệt độ và ánh sáng thích hợp, ít biến đổi, thông thoáng. Ở vùng Đông Nam Á thì những hột lan Vanda hay cây lai của Ascocentrum, Rhynchostylis… thường nẩy mầm tốt nhất ở nhiệt độ 270C và nhiệt độ ổn định là yếu tố quan trọng cho hạt lan nẩy mầm.
– Sau khi hạt nẩy mầm, thấy xuất hiện la thì nên cấy chuyển sang giai đoạn 2 ngay, sau khi cấy chuyển nếu môi trường phù hợp cây sẽ sinh trưởng rất nhanh, sau 6-8 tháng có thể mang cây con ra khỏi chai trồng ở bên ngoài để trồng. khi cấy chuyển phải hết sức cẩn thận, tránh sự lây nhiễm khuẩn và nấm.
Khi cây con đã lớn khoảng 5-12 tháng sau cấy chúng có thể được chuyển ra ngoài trồng, từ khi trồng đến khi cây có hoa dài, ngắn tùy giống có thể từ 2-7 năm, thời gian này có thể rút ngắn nếu môi trường nuôi cấy và có chế độ chăm sóc đặc biệt.
2. Nhân giống hoa lan vô tính
2.1. Tách bụi
Các cây lan sau khi đã phát triển chật chậu (lan đa thân: Cattleya, Dendrobium) phải được tách chiết để trồng lại.
– Đối với Cymbidium: dùng dao sắc đã khử trùng qua ngọn lửa để tách giò lan ngay sau khi hoa tàn. Vết cắt phải để khô nên bôi paraffin, vôi… Để giò lan đã tách vào đất ẩm, mỗi mắt ngủ sẽ cho một chồi mới. Mỗi chồi tách nên có gắn theo một số rễ, chú ý tách đúng chỗ nối liền giữa cây mẹ và nhánh con.
– Đối với Cattleya, Dendrobium và các giống tương tự thấy rằng: ở gốc của mỗi giả hành thường có ít nhất 1 mắt ngủ, nên có thể tách mỗi giả hành thành 1 đơn vị để trồng, điều này là bắt buộc đối với lan hài Paphiopedilum phải có 1 chồi già với 1 chồi non. Cách làm như sau: dùng dao sắc đã khử trùng để cắt đứt phần cưn hành giữa các giả hành, bôi vôi vào kín vết cắt. Có thể tách ra khỏi chậu rồi trồng ngay, nhưng cũng có thể sau tách vẫn giữ nguyên ở trong chậu đến khi mắt ngủ phát triển thành chồi cao, rễ bắt đầu xuất hiện ở gốc chồi thì mới tách các khóm lan nhỏ ra khỏi chậu để trồng. Trước khi tách ra khỏi chậu, cần tưới nước ướt đẫm cả chậu để rễ mềm, dễ tróc và nhấc cả khóm ra khỏi chậu. Rửa sạch để loại bỏ các giá thể cũ, cắt bỏ rễ già, rễ thối hoặc quá dài, chỉ chừa lại rễ có độ dài khoảng 5cm (không chạm vào các rễ non mới nhú ra từ gốc chồi mới), sau đó đem trồng vào chậu.
Phương pháp tách bụi thường tiến hành khi cây bò ra khỏi mép chậu, nhưng thường nhất là tiến hành đồng thời vào lúc thay chậu khi giá thể đã hết tác dụng. Tách bụi thường tiến hành sau thời kỳ lan nghỉ và bắt đầu bước vào thời kỳ lan nghỉ và bắt đầu bước vào thời kỳ tăng trưởng (cuối mùa mưa, đầu mùa khô) khi các mắt ngủ bắt đầu phình to ở giả hành và rễ bắt đầu nhú ra.
Khi thay chậu có thể kết hợp tiến hành tách cây, thông thường nhân giống bằng tách cây 3-4 năm tiến hành một lần vào mùa xuân hoặc mùa thu, nhưng mùa xuân tốt hơn, bởi vì lúc này mặc dù thời tiết bắt đầu ấm, nhưng rễ non, mầm non chưa phát sinh, phù hợp với tách cây, nếu tách cây vào mùa thu nên tiến hành vào tháng 10. Nhân giống bằng tách cây cần chọn những cây sinh trưởng khỏe, thường là mỗi khóm 10 mầm trở lên là vừa. Những cây được chọn làm cây mẹ để tách cây trước khi tách cây vài tháng cần thỏa mãn cây được phát triển trong điều kiện dinh dưỡng đầy đủ, nhờ đó tích lũy được nhiều chất hữu cơ, tạo cơ sở dinh dưỡng tốt sau khi tách làm cây dễ sống, phục hồi nhanh. Trước khi tách 7-10 ngày cần khống chế nước giữ cho giá thể hơi khô tiện cho thao tác tách cây, tránh được đứt rễ khi cho cây ra khỏi chậu.
Các bước tiến hành như sau: trước hết nhẹ nhàng cho cây ra khỏi chậu, dùng kéo cắt cẩn thận lá khô, rễ và xen xét kỹ trạng thái của cây, xác định chỗ cắt, khi cần thiết có thể dùng một số thuốc khử trùng để tiêu độc. Đặt khóm lan vào chỗ khô mát, sau đó dùng dao sắc cắt thành vài khóm, cũng có thể dùng kéo để cắt, nhưng phải hết sức cẩn thận tránh tổn thương mầm rễ, sau đó lại dùng thuốc diệt khuẩn bôi vào vết cắt rồi đem trồng vào chậu, trước khi trồng phải tưới thêm nước cho giá thể, sau khi trồng tạm dừng tưới nước 3-5 ngày, sau khi vết cắt lên sẹo mới tưới nước đẻ cố định rễ. Điều kiện thích hợp cho cây lan mới trồng là phòng có đủ ánh sáng, thông thoáng, ban đêm chiếu bằng ánh sáng trắng khoảng 5-6 giờ, hàng ngày phun qua nước 1 lần, 3 ngày bón phân qua lá 1 lần cho đến khi ra rễ non mới đưa ra ngoài chăm sóc. Sau khi đưa ra ngoài sẽ tăng dần lượng chiếu sáng, mỗi tuần phun một lần KH2PO4 hoặc chất kích thích sinh trưởng và các nguyên tố vi lượng. Sau 3 tháng tưới nước phân loãng chủ yếu là phân kali, ít đạm. Khi mầm cây hoa lan dài khoảng 2cm, cần tăng lượng chiếu sáng tùy từng điều kiện mà 3-5 ngày/lần phun qua lá và 9-10 ngày/lần tưới vào gốc.
Một số bước tiến hành tách và trồng lan tách vào chậu
2.2. Nhân giống hoa lan bằng thân giả
Nhân giống bằng thân giả tức là sử dụng thân giả có thể không lá hoặc không rễ, nhưng vẫn chắc mập để nhân giống. Bởi vì mỗi thân giả thường có mấy mầm ngủ, khi nó bị tách khỏi cơ thể mẹ sẽ có khả năng nẩy mầm. Thân giả có thể chỉ có một nhưng cũng có thể là vài thân giả liền với nhau. Khi thân giả bắt đầu nẩy mầm cắt bỏ các rễ khô và các rác rưởi sau đó ngâm vào Vitamin B12 khoảng 30 phút, sau đó dùng bông ướt cuốn lại, sau nửa ngày mới đưa vào chậu để trồng. Cần chú ý chỉ cần lấp một nửa thân ngầm, loại có rễ và không rễ trồng riêng. Nếu có lá giả phải cắt bỏ đi giảm bớt bốc hơi nước và tiêu hao dinh dưỡng của cây. Cây có một thân giả là tốt nhất, chậu không nên quá to, dùng 4 phần rễ mục trộn lẫn với 6 phần cát để làm giá thể. Thân giả có rễ dễ mọc mầm, sinh trưởng khỏe, dễ chăm sóc. Với những thân giả chưa có rễ có thể trồng mỗi chậu vài cây, nhưng chậu phải to hơn và thoát nước tốt, dùng 2 phần lá mục trộn lẫn với với cát thô, sau khi trồng ngâm chậu vào trong thuốc tím. Khi nào thuốc tím ngấm vào giá thể thì nhấc ra, để ráo nước rồi đưa vào nhà ươm giống thông thoáng râm mát tránh mưa. Phương pháp giữ ẩm cho giá thể thường làm là đặt chậu chìm sâu dưới mặt đất. Khoảng sau nửa tháng mỗi ngày cho chiếu sáng nửa ngày, đất khô phải tưới nước như vậy khoảng 2 tháng sau nẩy mầm. Lúc này đưa vào vườn ươm có che nắng để trán ánh sáng trực xạ, chú ý khống chế nước, đến khi mầm dài 2cm, cho tiếp xúc với ánh sáng tán xạ hoặc cho tiếp xúc với ánh sáng nhẹ trước 8h30 phút sáng, lúc này độ ẩm giá thể cần điều chỉnh cho phù hợp, nên để hơi khô, thỉnh thoảng phun chất dinh dưỡng theo định kỳ. Chăm sóc cây khoảng 4-6 tháng có thể thành cây trồng. Mầm mới đem trồng với đất pha cát (hơi chua) trộn với đất bùn hoặc giá thể khác. Sau khi trồng một tuần, mỗi ngày phun 2 lần. Khi nào cây giống đã sống mới chuyển sang chăm sóc bình thường. Thân giả bị tách lấy mầm được chăm sóc cẩn thận, sang năm vẫn có thể nẩy mầm.
2.3. Nhân giống bằng tách nhánh
Ở một số loài lan (Dendrobium, Thunia…) thường có hiện tượng tạo cây con trên giả hành một cách tự nhiên, khi cây con này có rễ là có thể tách ra khỏi giả hành để trồng.
Đối với một số loài lan đơn thân (Vanda, Arachnis…) khi thân cao lớn có thể cắt phần ngọn 30-50cm có ít nhất 2-3 tầng rễ để trồng. Phần gốc bên dưới nếu có lá vẫn có thể ra chồi bên, từ đó có thể tách ra trồng như trên.
Đối với lan Vanlilla và Vanda có thể cắt thân ra từng đoạn 3-4 đốt để trồng vì loại này rất dễ hình thành rễ bất định.
2.4. Nuôi cấy mô tế bào
Nuôi cấy mô tế bào còn được gọi là nuôi dưỡng ngoài cơ thể. Nó được nuôi dưỡng vô trùng từ các cơ quan của cây như là lá, hoa, quả, rễ và kể cả tế bào. Nuôi cấy mô hoa lan mới được nghiên cứu và ứng dụng, nhưng phát triển rất nhanh, đã hình thành cả một hệ thống nhà xưởng hoàn chỉnh, sản xuất theo mục đích hàng hóa. Người ta có thể dùng thân, rễ, củ, các lát cắt để nuôi dưỡng thành cây giống. Phương pháp nhân giống này vừa nhanh vừa không phụ thuộc vào thời tiết. Có thể sản xuất quanh năm, tiết kiệm đất, lao động, cây sản xuất từ ống nghiệm sạch bệnh và cũng có thể kết hợp với kỹ thuật mới để tạo ra giống cây sạch bệnh, nâng cao chất lượng cây giống, phù hợp tiêu chuẩn lan quốc tế. Đặc biệt phương pháp này có thể kết hợp với phương pháp nhân giống cổ truyền là đẻ tạo ra các cá thể lai ưu tú sớm trở thành giống tốt có tính trạng ổn định. Tồn tại lớn nhất của phương pháp này là giá thành cao, khó thao tác, cây lan ra hoa muộn, và cũng có thể sản sinh biến dị vô tính, bất lợi cho việc duy trì của giống. hiện nay ngoài các trường Đại học và các Viện nghiên cứu, các cơ sở chuyên nhân giống, các doanh nghiệp chuyên trồng lan cũng tích cực nghiên cứu hệ thống nuôi cấy mô phù hợp với điều kiện gia đình và đạt hiệu quả kinh tế cao.
2.4.1. Xây dựng hệ thống nuôi cấy mô tại gia đình
Xây dựng phòng vô trùng tại chỗ là vấn đề quan trọng nhất trong việc xây dựng hệ thống nhân giống nhanh cây lan bằng cấy mô tại gia đình. Diện tích phòng cấy mô vô trùng không quá lớn chỉ cần đặt được một tủ cấy mô vô trùng và có chỗ thao tác là được. Trong phòng vô trùng có một bảng đèn tử ngoại kết hợp với phun diệt khuẩn và dùng acid sunfuric đậm đặc pha thêm một ít thuốc tím để phun theo định kỳ. Tủ vô trùng có thể tự làm và cũng có thể mua tại những nơi chuyên sản xuất tủ nuôi cấy mô thực vật hoặc tủ vô trùng của y tế.
Để vô trùng môi trường và dụng cụ cần có nồi áp suất gia dụng (nếu có nồi hấp của y tế là tốt nhất), bếp điện (nồi vi sóng). Ngoài ra còn cần các dụng cụ như sau:
– Một cân phân tích (100g)
– Một nồi inox hoặc nồi nhôm (1-2 lít)
– Một máy ép hoa quả
– Đèn cồn, kéo y tế, dao mổ, đũa cấy mô, bình tam giác, bình đong, bình chứa dung dịch, hộp petri, ống hút, ống nhỏ giọt, bông, găng tay cao su và giấy lọc…
– Nếu có điều kiện có thể mua thêm tủ sấy, máy lắc…
Trong quá trình thao tác, tất cả các dụng cụ chịu được nhiệt độ cao đều phải khử trùng bằng nồi áp suất. nồi áp suất gia dụng không có đồng hồ đo, khi diệt khuẩn chưa đậy nắp ngay mà đun cho nước sôi sủi bọt, hãy đậy nắp để khử trùng trong vòng 20-25 phút, sau đó để nguội tự nhiên. Những dụng cụ không chịu nhiệt thì dùng hóa chất để khử trùng.
Ở một số nơi có thể tự chế tủ cấy mô vô trùng, các phần chính như sau:
Tủ cấy mô vô trùng tuy đơn giản nhưng rất thực dụng, có thể làm bằng gỗ, gỗ dán, kính hoặc kính hữu cơ, to nhỏ tùy thuộc vào nhu cầu, thông thường rộng 60-70cm, sâu 40-45cm, cao 50cm, phía dưới đục 2 lỗ thao tác, bên ngoài có nắp. Như vậy có thể thò tay vào để thao tác vừa giảm được ô nhiễm, trên tủ có bóng đèn 25W và một bóng đèn cực tím 8-20W.
Phần dưới bên phải mặt sau và phía trên mặt trái, để lỗ thông hơi đường kính 10cm, dưới lỗ thông hơi xếp 5-6 lớp vải màn cho khí vào, trên lỗ xếp 2-3 lớp vải màn cho khí ra, để tiện cho không khí lưu thông. Bên phải trái có thể cho một phía để lắp cửa lùa để có thể đưa những dụng cụ vào ra dễ dàng. Trước khi sử dụng 2-10 tiếng có thể bỏ 2-4g thuốc tím vào trong lọ miệng rộng sau đó đổ 10-20ml phoocmon vào, tạo thành phản ứng, hơi phoocmon bốc lên sẽ có tác dụng khử trùng. Trước khi thao tác bỏ bình ra, nếu phối hợp với bật bòng đèn cực tím sẽ có tác dụng vô trùng tốt hơn.
2.4.2. Dung dịch cấy mô thường dùng và cách pha chế
Dinh dưỡng cho nhân nhan giống hoa lan thường dùng phương pháp pha chế của MS (Muzashige và Skooy, 1962); VW (Vacin và Went, 1949); BS (Gabozg, 1968); White (1949). Nhân giống lan trong gia đình nên dùng môi trường MS, tùy từng giai đoạn có pha thêm chất kích sinh trưởng với nồng độ khác nhau.
Phương pháp pha chế chất dinh dưỡng dùng trong nhân giống lan
Các hóa chất thông dụng trong nhân giống lan gồm 5 loại đa lượng của dinh dưỡng MS (NH4HO3, KNO2, CaCl2.2H2O, MgSO4.7H2O, H2PO4, thuốc tím, phoocmon, đường trắng, dầu quỳnh, cồn y tế, giấy lọc pH (pH 5.4-7.0), bột tẩy trắng đa dụng hoặc thuốc tẩy trắng, một số nguyên tố vi lượng của MS, phụ liệu hữu cơ và ít chất kích thích, được cân bằng cân phân tích, cũng có thể mua tại các viện nghiên cứu hoặc cơ sở chuyên nhân giống dinh dưỡng pha sẵn để vào tủ lạnh dùng dần. Chất dinh dưỡng sau khi pha xong phải được khử trùng bằng nồi cao áp mới được sử dụng. Đối với cơ sở chuyên nhân giống, để tăng hiệu quả cả quá trình phải thay 3-4 loại dinh dưỡng như loại dinh dưỡng cho thân phình to, loại cho thân giả phát triển, loại cho thân giả phân hóa nẩy mầm và loại cho ra rễ. Cũng có khi dùng thêm loại dinh dưỡng tăng sinh trưởng cho cây giống. Thường là các giống lan khác nhau, thích ứng với các loại dinh dưỡng nhân giống khác nhau. Nhưng bất luận loại nào, những thành phần chủ yếu vẫn là đạm, lân, kala, canxi, ma nhê, lưu huỳnh, sắt, Bo, Mg, Cu, Zn, Mo, Cl, I… và một số chất hữu cơ kích thích sinh trưởng, đường trắng. Đặc biệt là các chất kích thích sinh trưởng mặc dù nồng độ rất thấp nhưng rất quan trọng cho tái sinh chồi, rễ của các mô lan.
Trước hết phải pha dung dịch mẹ, tức là loại dung dịch hỗn hợp, nhiều thành phần dinh dưỡng, có thể pha một lần dùng nhiều lần. Thông thường các muối được hòa tan trước sau đó được hỗn hợp lại. Bội số của dung dịch tỷ lệ nghịch với liều dùng, dùng ít với hệ số pha loãng lớn (100-1.000 lần), dùng nhiều hệ số pha loãng hơn (10-20 lần). Nguyên tố vi lượng và đa lượng phải pha riêng sau đó mới hỗn hợp với nhau. Khi hỗn hợp cần tách ion dương, âm tránh xẩy ra phản ứng hóa học dẫn đến kết tủa, thuốc của sắt phải pha riêng, có thể pha lẫn FeSO 4.7H 2O 5,57h với 7,54g chúng tôi trong 1000 ml nước, 1.000ml dung dịch dinh dưỡng chỉ cần lấy 5ml dung dịch mẹ để pha loãng. Các chất như acid glutamic, vitamin, kích thích sinh trưởng phải pha riêng tùy thuộc vào liều lượng để pha (10-100mg). Một số chất kích thích không hòa tan trong nước như IAA, IBA, GA, αNAA phải dùng cồn 95% làm dung môi, một số chất như 2,4D phải dùng 1 mol NaH 2 O để hòa tan, hoặc 6-BA dung 1 mol NaCl để hòa tan, sau đso mỡi hòa loãng bằng nước. Nồng độ thường được biểu thị bằng mg/l, sau khi pha xong đưa vào tủ lạnh để bảo quản.
Khi đã có sẵn dung dịch mẹ, sẽ căn cứ vào loại dung dịch dùng cho cấy mô mà pha loãng, trước hết hãy lấy dung dịch của các nguyên tố đa lượng sau đó theo thứ tự pha thêm dung dịch vi lượng như sắt, acid glutamic, vitamin, chất kích thích sinh trưởng và các phụ gia khác, tiếp đó dùng nước cất pha đến 1/2 định lượng, pha thêm nước đường và dầu quỳnh, đun lên cho hòa tan rồi điều chỉnh pH sao cho phù hợp với yêu cầu, tiếp tục pha thêm nước cất đến thể tích định sẵn, cuối cùng đổ dụng cụ vào thùng chứa dung dịch dinh dưỡng dùng cho cấy mô và đun ở 98 apmosphe, nhiệt độ 1210C để khử trùng, đến khi nguội thì bỏ ra.
2.4.3. Nuôi dưỡng mô
Nuôi dưỡng mô thông thường gồm 4 bước: Lấy mô vô trùng, hình thành thân tròn, cắt thân tròn thành nhiều mảnh, thân tròn phân hóa.
Nhân nhanh hoa lan có thể dùng cây con từ gieo hạt trong điều kiện vô trùng, đủ ra rễ chưa có lá để làm vật liệu nuôi cấy. Các mô được cắt trong điều kiện vô trùng đưa vào dịch dinh dưỡng cho hình thành thân tròn, chủ yếu dung dịch dinh dưỡng này là: 0,5-1,0mg/l, NAA + 0,1 – 1,0mg/l, 6-BA và 10% nước dừa.
Sau một thời gian nuôi dưỡng trong bóng tối sẽ hình thành thân tròn màu trắng, sau đó đưa ra nuôi dưỡng trong điều kiện ánh sáng yếu với nhiệt độ 250 thân tròn sẽ chuyển màu xanh. Thân hình tròn sẽ được chuyển vào dung dịch 1/2 MS + nước hoa quả hoặc MS + 2mg/l NAA + 1000mg/l than hoạt tính hoặc MS + 2mg/l NAA + 5% nước dừa + 2% tha hoạt tính với nhiệt độ trong phòng 25 + (-) 10C, ẩm độ 60-70%, ánh áng 2.000 Lux, mầm sẽ phát triển nhanh.
Nhân nhan hoa lan cũng có thể dùng mầm từ 7-8cm dưới gốc của những cây sinh trưởng khỏe, đem rửa bằng xà phòng và phun bằng nước máy khoảng 10-15 phút cho sạch, sau đó trong điều kiện vô trùng cắt lấy nửa trên của mầm, bóc đi 1/2 lá bên ngoài, sát trùng qua bằng cồn 250C rồi ngâm vào NaCl 10% khoảng 10 phút, lắc nhẹ làm tăng hiệu quả khử trùng, khi bỏ ra lập tức rửa bằng nước vô trùng. Bóc tiếp 2-3 lá rồi đưa vào khử trùng 5 phút trong nước muối, lấy ra rửa bằng nước vô trùng và bóc đến lá cuối cùng.
Cây lan được nhân giống bằng nuôi cấy mô (Ảnh Nguyễn Vũ Thị Hoàng Uyên, 2005)
Các bước tiến hành nuôi cấy mô tế bào
1. Cắt lấy điểm sinh trưởng
2. Đưa mẫu vào dung dịch cấy mô
3. Nuôi dưỡng trong dung dịch
4. Phân chia tế bào
5. Cắt thành miếng nhỏ
6. Hình thành thân hình cầu
7. Tách thân hình cầu
8. Nuôi dưỡng thân hình cầu phân hóa
9. Hình thành nhóm cây con
10. Tách cây con
11. Nuôi dưỡng cây khỏe
12. Đưa ra trồng
13. Trồng vào chậu
Sau đó lấy điểm sinh trưởng làm trung tâm cắt thành hình vuông chừng 0,3-0,4cm đưa vào nước muối ngâm 1 phút, bỏ ra rửa vài lần bằng nước vô trùng, dùng dao mổ cắt thành vài miếng, các miếng cắt lần lượt được cấy vào dung dịch MS + 0,1+0,2mg/l NAA hoặc ½ dung dịch 6-BA 0,5-2mg/l rồi đưa vào phòng nhiệt độ 24-250C và ánh sáng tán xạ, cường độ ánh sáng khoảng 1.500-2.000 lux. Thời gian chiếu sáng khoảng 12 tiếng để tạo thân hình cầu. Như vậy sau khoảng 4-6 tuần mô sẽ hình thành nhiều thân hình cẩu, nếu như cắt thân thành nhiều mảnh hoặc dùng máy ép bằng kính ép vỡ rồi lại cấy vào dung dịch, trong một thời gian ngắn sẽ hình thành nhiều thân hình cầu, hình thái và tỷ lệ hình thành thân hình cầu phụ thuộc vào dung dịch nuôi dưỡng. Có giống trên bề mặt phủ kín lông tơ màu trắng, có giống thưa hơn. Hình thái thân hình cầu ổn định thì sẽ dễ dàng nuôi dưỡng, chỉ cần đưa vào dung dịch 1/2 MS + nước rau quả thích hợp hoặc dinh dưỡng MS + 2mg/l NAA + 1000mg/l than hoạt tính, sau 1-2 tháng nuôi dưỡng sẽ hình thành nhiều thân hình cầu và sinh trưởng thành từng bụi. Có nhiều nghiên cứu cho thấy trong thời gian nhân giống không nên pha chất kích thích sinh trưởng vào dung dịch hoặc cố gắng hạn chế làm thay thế bằng dịch hoa quả, thân hình cầu phân hóa thành mầm được thuận lợi, cây giống ít phát sinh biến dạng. Còn dùng chất phân chia tế bào không thỏa đáng, thân hình cầu phân chia không bình thường, có lúc không ra được mầm hoặc hình thành lá dày, cây không bình thường. Ngoài ra quá trình phân bào nồng độ ion không quá cao, vì dễ dẫn đến cây phát triển không bình thường. Nếu có thể nên dùng dung dịch huyền phù để tăng tốc độ nhân giống. Để tăng lượng không khí và thay đổi không khí trong dung dịch thông thường nên dùng máy lắc (60-120 lần/phút) hoặc máy quay (2 vòng/phút), thông thường dùng máy quay tốt hơn máy lắc. Khi cây con cao 2-3cm, có thể cắt và chuyển đến dung dịch 3/4 MS + dịch hoa quả + vi lượng dung dịch MS + nước rau quả để nuôi dưỡng từ 1-3 tháng cây sẽ cao từ 10-15cm có 3-4 lá, và 2-3 rễ có thể đem trồng.
2.4.4. Trồng và chăm sóc cây con từ phòng cấy mô
Cây được đem trồng trog điều kiện nhiệt độ phù hợp. Trước khi đưa ra trồng 2-3 ngày, mở nắp bình tam giác đựng cây giống làm cho cây thích nghi với môi trường tự nhiên rồi mới lấy ra. Nếu miệng bình rộng nên đổ vào một ít nước lắc nhẹ để cho dung dịch tan đều rồi hãy cho nước sạch vào rửa, nếu miệng bình nhỏ sau khi đổ nước lắc nhẹ rồi dùng dây thép móc ra, tránh làm tổn thương rễ, nếu như cây to và nhiều rễ chỉ có cách đập vỡ bình để lấy cây (bọc bình và cây bằng miếng vải rồi dùng búa đập nhẹ, nhưng phải chú ý tránh làm hỏng cây và gây thương tích cho người). Cây con được rửa bằng nước sạch, dùng chổi lông quét sạch những thứ bám vào cây, sau khi rửa nên dùng nước sạch dội qua cho sạch, nếu không cây dễ bị thối rữa. Cây con sau khi rửa sạch tiến hành phân loại to nhỏ và xếp lên giá có lót bằng giấy báo, có thể dùng thuốc diệt khuẩn phun phòng, chờ cho cây ráo nước mới đem trồng.
Cây con được đưa vào chậu thông khí thoát nước tốt. Nên dùng rêu để làm giá thể, rêu được ngâm, rửa sạch, ép khô với độ ẩm nhất định và vô trùng. Trước khi đưa cây vào trồng, đáy chậu được phủ một lớp rêu dầy khoảng 1cm, rễ cây được cuốn bằng rêu, sau đó đặt vào chậu theo mật độ đã định. Cần phân loại cây to nhỏ để dễ chăm sóc. Cây được chèn cho vững, không quá lỏng. Cây con lúc này rất yếu nên phải được đặt vào những nơi râm mát, thông thoáng, ánh sáng yếu, ẩm độ cao. Sau trồng phun nước tưới ẩm cho cây và giá thể đủ ẩm. Tiếp đó mỗi ngày phun vài lần, không quá khô hoặc quá ẩm. Sau 7-10 ngày tăng dần lượng nước. Sau 2 tuần mỗi tuần phun 1 lần thuốc bảo vệ thực vật, khoảng 3 tuần sau cây mọc rễ non. Khi đó có thể tăng dần ánh sáng và mỗi tuần phun phân qua lá một lần có thể phun bằng KH2PO4 0,1-0,2% khoảng 6-8 tháng khi cây cao 15cm có thể tách trồng riêng rẽ mỗi chậu một cây. Thường dùng loại chậu có đường kính từ 8-9cm, khi nào cây cao 60cm chuyển sang chậu 12cm. Sau một năm khi thân giả to mập và nhú mầm lại đổi sang chậu to đường kính 16-18cm.
Nguồn: Giáo trình Hoa Lan – Đại học Thái Nguyên (Trường Đại học Nông Lâm)