Cập nhật nội dung chi tiết về Nuôi Cấy Mô Invitro Lan Hài Paphiopedilum mới nhất trên website Vitagrowthheight.com. Hy vọng thông tin trong bài viết sẽ đáp ứng được nhu cầu ngoài mong đợi của bạn, chúng tôi sẽ làm việc thường xuyên để cập nhật nội dung mới nhằm giúp bạn nhận được thông tin nhanh chóng và chính xác nhất.
Nhân giống invitro lan Hài Paphiopedilum:
Paphiopedilum là một trong những loài lan nổi tiếng và cũng khá hiếm. Các thành viên của loài này được bán và trưng bày dưới dạng chậu cây cảnh và hoa cắt cành. Các quần thể hoang dã của Paphiopedilum đang bị đe doạ bởi sự tuyệt chủng do sự khai thác quá mức và mất môi trường sống thích hợp.
Xem tất cả bài viết vềinvitro Hoa Lan
Việc giảm giá trị thương mại thông qua việc nhân giống trong ống nghiệm với quy mô lớn là một giải pháp để giảm áp lực từ việc khai thác bất hợp pháp, cố gắng đáp ứng các nhu cầu thương mại và thiết lập lại các loài bị đe doạ để đưa trở lại hoang dã. Mặc dù Paphiopedilum được nhân giống thương mại hóa thông qua việc nảy mầm không cộng sinh, nhưng vẫn được xem là khó nhân giống in vitro, đặc biệt là sự tái sinh cây con từ nuôi cấy mô. Đánh giá này nhằm mục đích đề cập đến các khía cạnh quan trọng nhất và cập nhật nghiên cứu tiến bộ trong nhân giống in vitro Paphiopedilum đồng thời nhấn mạnh tầm quan trọng của việc cải tiến thêm các quy trình nuôi cấy mô từ các mẫu cấy ex vitro.
Giới thiệu phương pháp nhân giống in-vitro Lan Hài Paphiopedilum
Paphiopedilum Pfitzer (Orchidaceae) thường được biết đến là lan hài vì hoa của chúng có hình cái túi giống như chiếc hài của phụ nữ. Các thành viên của chi này là một trong những loài hoa lan phổ biến nhất và được thương mại hóa dưới dạng những chậu hoa kiểng và hoa cắt cành vì chúng có rất nhiều hình dạng hoa, kích cỡ và màu sắc, đã thu hút sự quan tâm của nhiều người trồng lan và những người chơi lan. Paphiopedilum là một trong những giống lan phổ biến và hiếm được bán và trưng bày ngày nay (Cribb, 1998, Liu và cộng sự, 2009, Sheehan & Sheehan, 1994). Chi Paphiopedilum có khoảng 96-100 loài và phạm vi phân bố của nó trải dài từ phía đông Ấn Độ qua miền Nam Trung Quốc đến Philippines, Đông Nam Á và quần đảo Mã Lai đến New Guinea và quần đảo Solomon (Cribb, 1998; Liu và cộng sự, 2009, World Checklist of Selected Plant Families, 2014, Wu và cộng sự, 2009). Các quần thể tự nhiên đang bị đe doạ bởi sự tuyệt chủng do hậu quả của việc khai thác quá mức và mất môi trường sống thích hợp, và tất cả các loài Paphiopedilum được liệt kê trong Công ước về thương mại quốc tế các loài động, thực vật hoang dã nguy cấp (CITES) Phụ lục I. Theo CITES, việc buôn bán các loài này là bị cấm (Zeng và cộng sự, 2012).
Đến nay đã có 75 nghiên cứu được báo cáo về sự nhân giống in vitro các loài Paphiopedilum và cây trồng, trong đó có gần 32 loài bản địa và hơn 30 giống lai. Tuy nhiên, có 58 nghiên cứu được báo cáo cho sự nảy mầm bằng hạt và hình thành PLB (Protocorm Like Bodies: thể tiền chồi) sau đó. Hầu hết các mẫu nuôi cấy của quá trình vi nhân giống Paphiopedilum được sử dụng có nguồn gốc từ nguyên vật liệu in vitro của giống lai Paphiopedilum và chỉ có ba báo cáo có nguyên vật liệu nguồn gốc từ các mẫu cấy ex vitro.
Sự nảy mầm không cộng sinh
Cho đến gần đây, do sự hạn chế trong các quy trình nuôi cấy mô, sự nhân giống thương mại Paphiopedilum của người trồng vẫn còn hoàn toàn thông qua việc nảy mầm không cộng sinh (Hong và cộng sự, 2008). Sự nảy mầm không cộng sinh từ hạt giống Paphiopedilum trưởng thành thường gặp nhiều khó khăn và khác biệt (Pierik et al., 1988, Stimart & Ascher, 1981). Sự nẩy mầm và phát triển của hạt Paphiopedilum chịu ảnh hưởng đáng kể bởi một số yếu tố, bao gồm sự trưởng thành của hạt, tiền xử lý hạt, thành phần môi trường nuôi cấy, điều kiện nuôi cấy và phương pháp nuôi cấy. Một số kết quả thí nghiệm, chẳng hạn như tỷ lệ nảy mầm của hạt giống của cùng một loài trên cùng một môi trường, đã được chứng minh là không nhất quán, ví dụ tỷ lệ nảy mầm của 120 ngày sau khi thụ phấn (DAP) của hạt P. armeniacum là 25.2% (Chen và cộng sự, 2004b) và 18.4% (Ding và các cộng sự, 2004) trên môi trường Robert Ernst (RE, Arditti và cộng sự, 1982).
Sự nảy mầm từ hạt và sự phát triển mầm đốt thân của Paphiopedilum
Sự nảy mầm, tăng trưởng của cây con và sự phát triển trong ống nghiệm của Paphiopedilum thường được chia thành 5 giai đoạn: (1A-F, Zeng và cộng sự, 2012): (1) quá trình tách vỏ hạt giống bằng cách phình to của phôi (quá trình nảy mầm); (2) sự xuất hiện của chồi (mô phân sinh non) và/hoặc rễ giả; (3) sự xuất hiện và sự kéo dài của lá thứ nhất; (4) sự hiện diện của một lá và một hoặc nhiều rễ; (5) sự hiện diện của hai hoặc nhiều lá và rễ, hình thành cây con. Tốc độ nảy mầm có thể đơn giản được tính trong mỗi giai đoạn phát triển (tức là mỗi đơn vị thời gian) bằng cách chia số lượng hạt cho số lượng các mầm đốt thân.
Ảnh hưởng của hạt giống trưởng thành và quá trình tiền xử lý đối với sự nảy mầm không cộng sinh Ở hoa lan, phôi hợp tử biệt hóa rất kém, và những mô phân sinh và lá mầm thường không có mặt tại thời điểm sự phát tán hạt (Yeung và cộng sự, 1996). Hiện nay, thông tin về sự phát triển phôi ở các loài Paphiopedilum là rất hạn chế, và chỉ có một vài báo cáo về P. insigne (Nagashima, 1982, Zinger & Poddubnaya-Arnoldi, 1966), P. godefroyae (Ren & Wang, 1987), P Delenatii (Lee và cộng sự, 2006) và P. hirsutissinum, P.appletonianum và P. armeniacum (Zhang và cộng sự, 2013). Những quan sát quan trọng và chi tiết được thực hiện bởi Lee et al. (2006), người phát hiện rằng thụ tinh xảy ra ở khoảng 60 và 75 DAP, hợp tử và mầm phôi có thể được quan sát trong các túi nang, mặc dù kết quả không được định lượng. Trong giai đoạn đầu của hình dạng cầu (90 DAP), sự phân chia tế bào bổ sung đã xảy ra ở lớp bên trong cũng như lớp bề mặt, dẫn đến sự phát triển của phôi hoàn thiện. Tầng nguyên bì rõ rệt đã được tìm thấy ở khoảng 105 DAP, khi 105 DAP, những bào quan nhỏ với các hạt tinh bột, ty thể, lipid và những không bào nhỏ đã được nhìn thấy dễ dàng trong các tế bào của phôi hoàn thiện. Khi phôi đạt đến giai đoạn hình cầu hoàn toàn (150 DAP), hoạt động phân bào ngừng lại. Một lượng lớn không bào trong tế bào chất giảm xuống và tế bào chất trở nên đậm đặc. Lớp vỏ hạt có nguồn gốc từ các tế bào bên trong và bên ngoài của noãn. Các tế bào của các lớp bên trong của vỏ hạt đã hình dạng mảnh mai, trong khi các lớp bên ngoài lại rộng hơn. Trong giai đoạn hình cầu của phôi (150 DAP), lớp ngoài của vỏ bắt đầu co lại và teo lại dần dần, và lớp biểu bì bao phủ toàn bộ phôi và vỏ bên trong noãn và phôi, tạo ra một hàng rào không thấm nước và sự hấp thu chất dinh dưỡng ở hạt giống P. delenatii trưởng thành. Giống như các loài lan khác, không thấy nội nhũ vì vỏ hạt của hầu hết cây lan thường xuất phát từ phần ngoài (Yeung và cộng sự, 1996) mặc dù vỏ hạt của P. delenati có nguồn gốc từ cả phần tế bào bên trong và bên ngoài. Ngoài ra, các hình thái đặc trưng của tế bào vận chuyển và không có lớp biểu bì trong thành tế bào sợi treo đã chứng minh giả thiết rằng sợi treo là điểm hấp thụ dinh dưỡng chính cho phôi phát triển ở P. delenatii (Lee và cộng sự, 2006).
Dưới các điều kiện nảy mầm thích hợp, phôi hoàn toàn hình thành và vỏ hạt có thể không bị hóa gỗ, cho phép nó có thể thẩm thấu được nước và các chất dinh dưỡng. Hạt 90-DAP chưa trưởng thành của Paphiopedilum wardii không nảy mầm và hóa nâu ngay sau khi cấy và hạt 120-DAP cần khoảng thời gian dài hơn 150-DAP để nảy mầm hoặc để trưởng thành hơn, cho thấy rằng những noãn lan còn non không thích hợp cho sự nảy mầm và có thể cần thời gian cho sự hình thành bộ phận hoặc tổng hợp các chất dinh dưỡng hoặc để giúp phôi nhận ra các chất kích thích có trong môi trường, do đó cho phép chúng nảy mầm (Nhut et al., 2005, Zeng và cộng sự, 2012). Ngoài ra, phôi có thể kém phát triển để hấp thụ chất dinh dưỡng từ môi trường (Long và cộng sự, 2010). 180 hạt DAP của P. wardii có thể nảy mầm tốt nhờ sự huy động protein hiệu quả trong quá trình bù nước và vỏ phôi chưa phát triển (Bảng 1, Rasmussen, 1995, Zeng và cộng sự, 2012). Một số yếu tố ảnh hưởng đến tỷ lệ nảy mầm của hạt Paphiopedilum trưởng thành: vỏ hạt không thấm nước (Van Waes & Debergh, 1986a), sự có mặt của các chất ức chế hóa học như abscisic acid (ABA), hoặc thiếu hormone kích thích sự nẩy mầm (Van der Kinderen, 1987). Trong các điều kiện nảy mầm thích hợp, phôi bào tử của hầu hết các hạt trưởng thành hoàn toàn và vỏ hạt có thể không bị hóa gỗ, cho phép nó có thể thẩm thấu được nước và các chất dinh dưỡng trong khi các hạt trưởng thành có thể có khả năng nhân giống và bảo quản lớn hơn do lớp vỏ hạt đã hoàn thiện và lượng nước thấp hơn (Miyoshi & Mii, 1998, Zhang và cộng sự, 2013).
Sự nảy mầm của hạt Paphiopedilum và sự phát triển mầm đốt thân được kích thích bằng phương pháp tiền xử lý phù hợp, bao gồm natri hypochlorite (NaOCl) hoặc NaOH (Lee, 2007, Liao & Chen, 2006, Zeng và cộng sự, 2012). Loại, nồng độ của dung dịch tiền xử lý và thời gian tiền xử lý là những yếu tố chính. Zeng và các cộng sự (2012) báo cáo rằng việc xử lý trước hạt giống P. wardii (360 DAP) với dung dịch NaOCl có chứa 0.5% Clo trong 60 phút hoặc 1.0% Clo trong 40 phút làm tang đáng kể tỷ lệ nảy mầm (70.33 và 67.67%) so với các phương pháp tiền xử lý khác và việc kiểm soát (dung dịch 0.1% HgCl2) và tất cả phương pháp tiền xử lý đã rút ngắn đáng kể thời gian cho sự nảy mầm. Việc tiền xử lý bằng NaOCl, NaOH hoặc Ca(OCl)2 có thể đã ăn mòn vỏ hạt và tăng tính thẩm thấu của hạt với oxy và các chất dinh dưỡng (Major & Wright, 1974, Rasmussen, 1995 Van Waes & Debergh, 1986 a, b), trong khi các chất ức chế như ABA có thể bị giảm trong hạt (Lee, 2007, Van der Kinderen, 1987). Tỷ lệ nảy mầm của hạt thấp hoặc không nảy mầm có thể là vì hạt bị hư hại do thời gian xử lý với NaOCl quá dài (Kaneko & Morohashi, 2003).
Hình 1. Nuôi cấy in vitro, phát triển cây con và đưa Paphiopedilum wardii Sumerh trở lại môi trường tự nhiên. (A) giai đoạn 0, hạt giống, không nảy mầm. (B) Giai đoạn 1, tvỏ hạt bị vỡ. (C) Giai đoạn 2, xuất hiện của rễ giả. (D) Giai đoạn 3, sự xuất hiện và sự kéo dài của lá thứ nhất. (E) Giai đoạn 4, một lá và xuất hiện rễ. (F) Giai đoạn 5, có hai hoặc nhiều lá. (G) Sự nảy mầm không cộng sinh trên môi trường 1/2 MS được bổ sung với NAA 0.5 mg/L, 10% CW (v/v) và 1.0 g/L AC. (H) và (I) Phát triển cây con trên môi trường Hyponex N026 bổ sung với NAA 1.0 mg/L, 10% CW và 1.5 g/L AC. (J) Sự phát triển của cây con trên môi trường Hyponex N016 chứa 1.0 mg/L NAA, 50 g/L BH và 1.5 g/L AC. (K) Cây hoa từ cây con in vitro trong nhà kính. (L) Thiết lập các cây con in vitro trong 12 tháng sau khi tái giới thiệu.
Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy lên sự nảy mầm không cộng sinhẢnh hưởng của môi trường cơ bản và pH
Bảng 1. Ảnh hưởng của mức độ trưởng thành hạt giống của Paphiopedilum lên sự nảy mầm trong ống nghiệm.
Xem ở bài viết gốc: https://khonggiansinhhoc.com/nhan-giong-vitro-lan-hai-paphiopedilum/
Tác động của nhiều môi trường khoáng chất cơ bản đã được thử nghiệm trên sự nảy mầm in vitro của hạt Paphiopedilum. Sự nảy mầm của hạt và phát triển cây con của Paphiopedilum bị ảnh hưởng mạnh bởi thành phần khoáng chất của môi trường cơ bản (Bảng 2). Hầu hết các loài Paphiopedilum thích môi trường khoáng thấp để nảy mầm hạt và sự ức chế nảy mầm của Paphiopedilum trên môi trường Murashige và Skoog (MS, Murashige & Skoog, 1962) có thể là do hàm lượng khoáng cao (Chen et al., 2004a; Ding et. Al., 2004, Long et al., 2010, Pierik và cộng sự, 1988), như là 1/2, 1/4, 1/6, 1/5 hoặc 1/8 MS (nghĩa là /2, 1/4, 1/6, 1/5 hoặc 1/8 lượng chất dinh dưỡng vi chất và vĩ mô) đã được chứng minh phù hợp hơn (Ding và cộng sự, 2004, Lee & Lee, 1999, Zhou và cộng sự, 2013).
Môi trường lý tưởng cho sự nảy mầm của cùng một loài Paphiopedilum là khác nhau. Ví dụ, Nhut et al. (2005) báo cáo hạt giống 9 tháng tuổi của P. delenatii được nuôi cấy trên môi trường Knudson C (KC) (Knudson, 1946), là tối ưu cho sự nảy mầm in vitro so với môi trường MS hoặc 1/2 MS. Tương tự, đối với P. wardii cho thấy sự nảy mầm là thấp hơn đáng kể trên môi trường MS so với môi trường MS 1/2 (Zeng et al., 2012). Tuy nhiên, khoáng chất không phải là yếu tố duy nhất ảnh hưởng đến sự nảy mầm của P. wardii bởi vì tỷ lệ nảy mầm của hạt thấp hơn đáng kể ở môi trường 1/4 MS – chứa hàm lượng khoáng chất thấp hơn so với môi trường 1/2 MS. Tuy nhiên, thành phần môi trường chính xác và tỷ lệ các khoáng chất khác nhau cũng có một ảnh hưởng đáng kể đến sự nảy mầm hạt P. wardii và phát triển cây con của P. wardii. Chẳng hạn, sự nảy mầm của hạt giống cao nhất là trên môi trường Vacin và Went (VW, Vacin & Went, 1949), nhưng chỉ có 14% mầm đốt thân phát triển thành cây con ở giai đoạn 5, thấp hơn đáng kể so với môi trường 1/2 MS và Hyponex N026, trong đó 52% các mầm đốt thân ở giai đoạn 2 đã chết (Zeng và cộng sự, 2012).
Pierik et al. (1988) báo cáo sự nảy mầm của P. ciliolare cao nhất trên môi trường KC và 1/4 MS và thấp hơn nhiều trên môi trường MS; KC dẫn đến cái chết của thực vật. Môi trường Thomale GD1 (Thomale, 1954) được sửa đổi đã cho thấy sự phát triển mầm đốt thân và tăng trưởng cây non cao hơn môi trường 1/4 MS. Sự nảy mầm của hạt P. ciliolare thấp hơn đáng kể trên môi trường 1/4 MS, mà chứa 3/4 hoặc toàn bộ muối vi lượng (trừ sắt) so với môi trường không có vi chất dinh dưỡng, nhưng sự nảy mầm của P. ciliolare không khác biệt đáng kể ở 1/4 MS chứa 1/4-, 1/2-, 3/4- hoặc toàn bộ các chất dinh dưỡng vi lượng. Sự nảy mầm của P. ciliolare không ảnh hưởng đáng kể bởi nồng độ NaFeEDTA, ở nộng độ 25 mg/L là tối ưu. Sự phát triển của cây được thúc đẩy mạnh mẽ bởi sắt, và tất cả các mầm đốt thân và cây con chết trong quá trình xử lý ánh sáng trong môi trường không chứa sắt.
Trong hầu hết các nghiên cứu Paphiopedilum, sự nảy mầm của hạt có thể đạt được ở pH 5.0-6.0 (Ernst, 1975, 1980, Fast, 1971, Flamee, 1978; Thomale, 1957, Zeng và cộng sự, 2012). Pierik et al. (1988) báo cáo rằng pH (5.5, 6.0, 6.5 và 7.0) của môi trường hầu như không ảnh hưởng đến sự nảy mầm của P. ciliolare, phản ứng tốt hơn ở pH 5.5 và 6.0, mặc dù không đáng kể, so với pH 6.5 và 7.0 . Hơn nữa, phát triển dưới ánh sáng rõ ràng là tốt hơn ở pH thấp, và pH 7.0 gây ức chế mạnh mẽ đến sự phát triển của cây con (Pierik và cộng sự, 1988).
Nguồn carbon
Carbohydrate như một nguồn năng lượng trong môi trường nuôi cấy vừa và chất thẩm thấu có ảnh hưởng đáng kể đến sự nảy mầm của Paphiopedilum và sự phát triển mầm đốt thân. Sự nảy mầm của hạt Paphiopedilum không xảy ra nếu không có đường (Fast, 1971, Pierik và cộng sự, 1988). Sucrose là nguồn carbon sử dụng nhiều nhất cho sự nảy mầm của cây lan Paphiopedilum (Chen và cộng sự, 2004a, Ding và cộng sự, 2004, Hossain và cộng sự, 2013, Zeng và cộng sự, 2012). Tuy nhiên, các nguồn carbon khác bao gồm glucose, fructose, maltose và mannitol, cũng được sử dụng trong một số nghiên cứu (Long et al., 2010 Pierik et al., 1988). Pierik et al. (1988) báo cáo rằng sự nẩy mầm cao nhất (48%) trên môi trường Thomale đã biến đổi với nồng độ đường thấp nhất (0.5% glucose + 0.5% fructose), cao hơn đáng kể so với môi trường với 1.0% glucose + 1.0% fructose (37%) hoặc trên môi trường có 1.25% đường glucose + 1.25% fructose (29%), nhưng không cao hơn đáng kể so với môi trường 0,75% glucose + 0.75% fructose (41%). Long et al. (2010) báo cáo tỷ lệ nảy mầm cao hơn đáng kể (19%) của P. villosum var. densissimum trên môi trường bổ sung 2 g/L glucose so với môi trường bổ sung 2 g/L sucrose, hoặc môi trường bổ sung maltose 2 g/L hoặc malnose (0.08%). Maltose là một nguồn đường hiệu quả cho sự tăng trưởng của cây Oncidium “Vũ nữ” (Jheng et al., 2006) mặc dù Long et al. (2010) nhận thấy rằng maltose ít hiệu quả hơn glucose hoặc sucrose trong việc thúc đẩy sự nảy mầm của Paphiopedilum.
Chất điều hòa tăng trưởng thực vật
Các chất điều hòa tăng trưởng thực vật khác nhau có những ảnh hưởng khác nhau đến sự nảy mầm của các loài lan khác nhau (Teixeira da Silva, 2013a). Hầu hết hạt giống Paphiopedilum có thể nảy mầm bình thường khi không có PGR( plant growth) ngoại sinh. Hegarty (1955) đã quan sát tác động kích thích của indolo-3-butyric acid (IBA) đối với sự nảy mầm của giống lai Paphiopedilum, Pierik et al. (1988) cũng nhận thấy auxin (0,001-1,0 mg/L indolo-3-acetic acid (IAA) và 0.001-1.0 mg/L IBA] có tác dụng kích thích nhẹ, nhưng không có cytokinin [0.001-1.0 mg/L N6-benzyladenine (BA) và 0.001-1.0 mg/L Kn cũng không acid gibberellic (0.001-1.0 mg/L GA3)] ảnh hưởng đến sự nảy mầm. Tuy nhiên, sự tăng trưởng và phát triển của cây con trong điều kiện ánh sáng ngày càng bị ức chế và biến dạng bởi nồng độ auxin, cytokinin và GA3 tăng lên. IBA là độc tính hơn (mặc dù tại sao nó được coi là độc hại không được định nghĩa) so với IAA, và sự ức chế bắt đầu ở 0.5 mg/L cytokinin và 0.01 mg/L GA3 (Pierik và cộng sự, 1988).Các chất bổ sung hữu cơ
Sự nảy mầm hạt giống hoa lan và sự phát triển mầm đốt thân được kích thích hoặc ức chế bởi các hợp chất hữu cơ (Chen et al, 2004b, Harvais, 1973, Zeng và cộng sự, 2012). Các hợp chất hữu cơ được sử dụng bao gồm một số loại nước hoa quả như nước dừa (CW), bột chuối (BH), bột khoai tây (PH) và hợp chất hữu cơ như casein hydrolysed (HC), dịch chiết nấm men, tryptone và peptone (Curtis, 1947; Fast, 1971; Lee & Lee; 1999, Long et al., 2010, Pierik et al., 1988).
Trong thí nghiệm với môi trường bổ sung với hợp chất hữu cơ, Chen et al. (2004b) báo cáo rằng khi môi trường KC bổ sung với dịch chiết nấm men 1.0 g/L, tỷ lệ nảy mầm của hạt P. armeniacum và P. micranthun giảm đáng kể. Curtis (1947) báo cáo tỷ lệ nảy mầm của hạt P. insigne và P. hirsutissimum trên môi trường bổ sung peptone 1.0-2.0 g/L là cao hơn so với môi trường không có peptone, trong khi đó báo cáo của Zeng et al. (2012) cho thấy tỷ lệ nảy mầm của P. wardii tăng lên đáng kể khi hạt được nuôi cấy trên môi trường 1/2 MS và bổ sung 0.5, 1.0 hoặc 1.5 g/L peptone so với môi trường không có peptone (Hình 1G). Tryptone cũng có ảnh hưởng chi phối đến sự nảy mầm của hạt Paphiopedilum và sự phát triển tiếp theo (Fast, 1971, Flamee, 1978, George và cộng sự, 2008, Lee & Lee, 1999, Pierik và cộng sự, 1988; Stimart & Ascher, 1981, Thomale, 1957, Zeng và cộng sự, 2012). Pierik et al. (1988) cho rằng tryptone (1.5, 2.0 hoặc 2.5 g/L) đã thúc đẩy đáng kể sự nảy mầm hạt P. ciliolare và sự phát triển của cây con. Lee & Lee (1999) báo cáo rằng môi trường 1/4 MS chứa 2 g/L tryptone thúc đẩy sự nảy mầm của hạt P. delenatii, P. bellatulum và P. primulinum. Zeng et al. (2012) cũng báo cáo rằng tỷ lệ nảy mầm của hạt P. wardii tăng đáng kể khi chúng được nuôi cấy trên môi trường 1/2 MS trộn với 1.0 g/L tryptone so với môi trường không có tryptone. Các hợp chất hữu cơ (HC, peptone và tryptone) thường bao gồm protein trọng lượng phân tử thấp, axit amin, vitamin và các chất tăng trưởng thực vật có khả năng tăng trưởng thực vật bằng cách cung cấp cho các tế bào thực vật với nguồn nitơ sẵn có (George và cộng sự, 2008). Ngoài ra, vitamin biotin và pyridoxin, đặc biệt axit nicotinic, có ảnh hưởng tích cực đến sự nảy mầm của hạt và tăng trưởng của cây con sau đó (Arditti, 1967, Lucke, 1971, Thomale, 1957, Withner, 1959). Lucke (1971) báo cáo rằng 0.0001% biotin làm tăng sự tổng hợp của chất diệp lục và thúc đẩy sự phát triển của cây con Paphiopedilum.
Trong các thí nghiệm của môi trường bổ sung với nước ép trái cây, Long et al. (2010) báo cáo tỷ lệ nảy mầm cao nhất của hạt P. villosum var. densissimum với 10% sữa dừa, trong khi tỷ lệ nảy mầm bằng cách sử dụng bột táo và khoai tây không vượt quá 3%, và 0% với su su và lactalbumin hydrolysate. Zeng et al. (2012) cũng báo cáo sự gia tăng đáng kể tỷ lệ nảy mầm khi P. wardii được nuôi cấy trên môi trường 1/2 MS và bổ sung 7.5, 10 và 15% CW (nhưng không có 5%) so với môi trường không có CW. CW chứa nhiều loại chất sinh học khác nhau, bao gồm các axit amin, vitamin, đường, khoáng chất và chất hormone thực vật (Yong và cộng sự, 2009) và các chất ức chế tự nhiên và các chất điều hòa bao gồm ethylene, ABA, phenol và sắc tố thực vật (Mamaril và cộng sự, 1988), tất cả đều có thể ảnh hưởng đến sự nảy mầm của hạt hoặc phát triển cây con. CW cũng bao gồm các ion vô cơ khác như phốt pho, magiê, kali và natri (Raghavan, 1977), có lợi cho sự nảy mầm hạt giống (Hossain và cộng sự, 2013, Teixeira da Silva, 2013a). Thành phần hoá học của CW bị ảnh hưởng bởi một số yếu tố bao gồm giai đoạn trưởng thành của dừa, đất và điều kiện môi trường (Jackson và cộng sự, 2004, Yong và cộng sự, 2009). Việc bổ sung BH vào môi trường thúc đẩy sự nảy mầm của hạt giống Paphiopedilum và các giống lai (Ernst, 1980), nhưng cũng có một tác dụng ngược lại (Fast, 1971, Pierik và cộng sự, 1988). Việc bổ sung BH vào môi trường cũng thúc đẩy sự phát triển của chồi và rễ cây con in vitro Paphiopedilum (Ernst, 1974, 1975, 1980, Fast, 1971, Pierik và cộng sự, 1988, Zeng và cộng sự, 2012, Hình 1H – J). Lee và Lee (1999) báo cáo rằng 20g/L PH có thể thúc đẩy sự nảy mầm của P. bellatulum, P. delenatii và P. primulinum, trong khi 20 g/L BH làm giảm sự nảy mầm của P. bellatulum, P. delenatii và P. primulinum. Zeng et al. (2012) báo cáo không có sự khác biệt về tỷ lệ nảy mầm của hạt trên môi trường 1/2 MS có chứa PH, và thấp hơn đáng kể trên môi trường 1/2 MS có chứa 75 hoặc 100 g/L BH so với môi trường không có bất kỳ sự bổ sung chất hữu cơ nào. BH bao gồm các khoáng chất, IAA, GA7 và GAx, zeatin, zeatin riboside và N6 -2 (isopentenyl) adenine (2iP) (Khalifah, 1966a, b, Van Staden & Stewart, 1975), thường được biết đến là thúc đẩy sự nảy mầm ở cây lan. Ngược lại, tác động ức chế của nồng độ BH cao đối với sự nảy mầm có thể là môi trường đó chứa quá nhiều đường hoặc các chất khác để cho sự nảy mầm hiệu quả ở Paphiopedilum, mặc dù nó thích hợp cho sự phát triển của cây trồng trong ống nghiệm.
Than hoạt tính
Không có mô hình hoàn thiện để biết liệu thêm than hoạt tính (AC) vào môi trường có thể cải thiện sự nảy mầm của hạt giống (Thomas, 2008). Nỗ lực đầu tiên để làm đen hóa môi trường nuôi cấy sử dụng cho sự nảy mầm của lan dường như đã được thực hiện trong nỗ lực nảy mầm loài Cypripedium bản địa châu Mỹ (Curtis, 1943). Đen hóa với than (không phải AC) có tác động tích cực đến sự nảy mầm của hạt và sự phát triển của cây con Paphiopedilum (Ernst, 1974, 1975). Ding và cộng sự (2004) cũng báo cáo rằng tỷ lệ nảy mầm của P. armeniacum được tăng lên trên môi trường 1/5 MS có chứa 2 g/L AC, cao hơn 36.1% so với môi trường 1/5 MS mà không có AC (9.6%). Tuy nhiên, Lee & Lee (1999) báo cáo rằng AC không thúc đẩy sự nảy mầm của P. delenatii và P. primulinum, nhưng có thể thúc đẩy sự nảy mầm của P. bellatulum. Pierik et al. (1988) báo cáo rằng ở nông độ 0.1 hoặc 0.2% AC hầu như không ảnh hưởng đến sự nảy mầm của P. ciliolare, nhưng trong ánh sáng, cả hai hàm lượng đều ức chế sự phát triển của cây.
Lời giải thích về hiệu quả tích cực của AC đối với sự nảy mầm của hoa lan là AC cải thiện sự sục khí, đồng thời bổ sung thêm vi chất, phân cực, ảnh hưởng đến nhiệt độ bề mặt hoặc hấp thụ các chất độc hại bao gồm phenolic, ngược lại không hấp thụ 1 số hợp chất như một số vitamin và hoocmon nhất định, kết quả là thụ động (Ernst, 1974, Thomas, 2008, Weatherhead và cộng sự, 1978. Yam và cộng sự, 1990).
Môi trường nuôi cấy lỏng
Không có kết quả thống nhất hoặc tiêu chuẩn về môi trường nuôi cấy lỏng để cải thiện sự nảy mầm của hạt Paphiopedilum. Lee và Lee (1999) đã báo cáo rằng sự nảy mầm của P. bellatulum, P. delenatii và P. primulinum có thể được nâng lên tỷ lệ cao hơn trong môi trường chất lỏng (58.2, 68 và 46.7%) so với môi trường dinh dưỡng rắn (36.5, 50.7 và 35.7%). Ding và cộng sự (2004) báo cáo rằng tỷ lệ nảy mầm của hạt không khác biệt đáng kể trong nuôi cấy lỏng hoặc rắn, mặc dù thời gian nảy mầm được rút ngắn và mức độ đồng bộ được tăng lên trong môi trường lỏng, dù cho ảnh hưởng này không được thống kê. Vasudevan & Van Staden (2010) cho rằng tăng khả năng nảy mầm trong môi trường dịch huyền phù có thể là do sự rửa trôi của vỏ hạt và sự pha loãng các chất ức chế thực vật.
Môi trường nuôi cấy ảnh hưởng đến sự nảy mầm của hạt Paphiopedilum Nhiệt độ nuôi cấy Trong hầu hết các nghiên cứu về Paphiopedilum, sự nảy mầm hạt có thể xảy ra ở nhiệt độ từ 22 đến 28 oC (Ernst, 1974). Pierik et al. (1988) báo cáo rằng mức độ nảy mầm của P. ciliolare ở 25 oC cao hơn so với ở 21 hoặc 29 oC.
Stimart & Ascher (1981) báo cáo rằng trong bốn môi trường (Burgeff EG-1, Thomale GD, KC, Norstog), Burgeff EG-1 thích hợp nhất cho sự nảy mầm của hạt và sự sống còn của ba giống lai Paphiopedilum (P. McLaren Park x P. White Fringe, P. Jack Tonkin Jason x P. Hellas Westonbint và P. parishii x P. curtisii var. Sandara) trong ánh sáng, trong khi đó Thomale GD thích hợp nhất cho sự nảy mầm và sống sót trong bóng tối. Tay và cộng sự (1988) báo cáo sự nảy mầm và phát triển mầm đốt thân tốt nhất của P. sukhakulii và các giống lai của nó khi đã được xử lý trước trên môi trường Norstog trong 6 tuần hoặc lâu hơn trong bóng tối. Trong nghiên cứu này, hầu hết các mầm đốt thân trong ánh sáng liên tục chuyển sang màu nâu và chết ở giai đoạn phát triển sớm, trong khi đó cây con phát triển tốt nhất là những con được thu được từ nhửng mầm đốt thân được đặt trên môi trường Burgeff EG-1 trong ánh sáng. Axit amin, được sử dụng trong môi trường Norstog, hỗ trợ sự nảy mầm của hạt và tăng trưởng mầm đốt thân nhưng cũng có thể ức chế sự hình thành chồi ở các hoa lan khác (Arditti, 1967, Harvais, 1982). Sự quang hợp trên môi trường Norstog có thể xảy ra do sự có mặt của các axit amin, mà việc sử dụng chúng có thể bị ảnh hưởng bởi ánh sáng (Arditti, 1967, Spoerl, 1948).
Zeng et al. (2012) báo cáo rằng hạt P. wardii có thể nảy mầm dưới chu kỳ ánh sáng 16 giờ mà không cần để trong tối trước đó hoặc trong bóng tối hoàn toàn và tỷ lệ nảy mầm không khác biệt đáng kể trên môi trường 1/2 MS có chứa NAA 0,5 mg/L, 10% CW và 1,0 g/L AC, mặc dù tỷ lệ nảy mầm của hạt sau khi nuôi cấy trước trong bóng tối 45 ngày sau đó chuyển sang chu kỳ sang 16 giờ là cao hơn đáng kể so với chu kỳ 16 giờ mà không có nuôi cấy trong tối trước, hoặc nuôi cấy trong tối hoàn toàn. Hiện nay chức năng chính xác của tiền nuôi cấy trong tối vẫn chưa được hiểu rõ. Ngoài ra, tất cả các mầm đốt thân được nuôi cấy liên tục trong bóng tối đã không phát triển đến giai đoạn 5. Kết quả này cho thấy ánh sáng là một yếu tố vật lý quan trọng kiểm soát sự phát triển của cây con, nhưng không nhất thiết cho sự nảy mầm.Nuôi cấy mô lan Paphiopedilum
Quá trình vi nhân giống hoa lan ra đời vào năm 1960 khi Morel lần đầu tiên nuôi cấy mô phân sinh chồi Cymbidium (Morel, 1960) nhưng Bubeck (1973) đã tiến hành nghiên cứu tiên phong để vi nhân giống Paphiopedilum, trong khi Morel (1974) ghi nhận quy trình nhân giống bằng nuôi cấy mô đỉnh chồi Paphiopedilum thành công đầu tiên. Tuy nhiên, Paphiopedilum được coi là khó tái tạo từ nuôi cấy mô do nguồn nguyên liệu hiếm, khó khăn do nhiễm bẩn vi khuẩn và nhiễm nấm của các mẫu có nguồn gốc từ ex vitro và sự phát triển kém của các loại thực vật sống dưới điều kiện in vitro.
Mẫu cấy, khử trùng bề mặt và khử trùng
Phản ứng hình thái học trong hoa phong lan thay đổi tùy thuộc vào mẫu mô (Chugh và cộng sự, 2009, Hossain và cộng sự, năm 2013). Các mẫu mô của cây lai Paphiopedilum thường được sử dụng trong vi nhân giống, cho thấy các giống lai Paphiopedilum có thể dễ dàng vi nhân giống hơn các loài bản địa (Chen et al., 2002, 2004a, b, Huang, 1988, Liao et al., 2011 Stewart & Button, 1975). Những mầm đốt thân, PLBs và cây con in vitro, hoặc các bộ phận của chúng, thường được sử dụng như là những mẫu mô ban đầu để nghiên cứu vi nhân giống Paphiopedilum, bao gồm đỉnh chồi (Huang và cộng sự, 2001; Ng và cộng sự, 2010), những lóng thân (Ng et al., 2010; Ng & Saleh, 2011; Nhut et al., 2007), PLBs (Lin và cộng sự, 2000, Zeng và cộng sự., 2013) hoặc mẫu lá (Chen và cộng sự, 2004a, Lin và cộng sự, 2000), mà không cần phải khử trùng. Cho đến nay, chỉ có ba báo cáo về quá trình vi nhân giống Paphiopedilum từ các mẫu mô ex vitro tồn tại (Huang, 1988, Liao và cộng sự, 2011. Stewart & Button, 1975). Stewart & Button (1975) đã sử dụng các thân hoa non và trưởng thành, đầu lá, rễ, nhị hoa, bầu nhụy và chồi đỉnh của ba loài Paphiopedilum trồng ngoài trời (P. villosum, P. fairrieanum, P. insigne). Huang (1988) đã sử dụng đỉnh chồi của cây lai Paphiopedilum, khử trùng chúng bằng cách ngâm trong dung dịch chứa 0.5% NaClO 15 phút dưới áp chân không nhẹ, sau đó, dưới kính hiển vi cắt lớp, các đỉnh chồi khoảng 2-3 mm đã được cắt bỏ, để giảm sự nhiễm trùng. Ngoài ra, môi trường MS, chứa 100-500 mg/L carbenicillin và / hoặc cefotaxime (kháng sinh) được lọc khử trùng, có hiệu quả hạn chế sự nhiễm bẩn vi khuẩn ở các môi trường nuôi cấy ban đầu. Liao et al. (2011) báo cáo rằng những mảnh lát ngang của các giống lai Paphiopedilum (P. Deperle và P. Armeni White) có thể tạo nên các chồi nụ bất định và tái sinh.
Các phương thức phát triển trong ống nghiệm và các yếu tố ảnh hưởng đến các phương thức phát triểnSự kích thích mô sẹo và PLB
Các chất điều hòa tăng trưởng thực vật (PGRs), bao gồm auxin (2,4-D), cytokinin [BA, thidiazuron (TDZ) và Kn] và những hợp chất khác như PBOA (phenylboronic acid), đã được sử dụng để kích thích sự hình thành mô sẹo và PLB (Lin et al., 2000, Long và cộng sự, 2010, Luan và cộng sự, 2012, Stewart & Button, 1975). PGRs phù hợp nhất là 2,4-D, TDZ hoặc sự kết hợp của chúng. Stewart & Button (1975) đã báo cáo rằng chồi đỉnh có thể tạo ra mô sẹo trên môi trường Heller (Heller, 1965) có chứa 1,0 mg/L 2,4-D có hoặc không có 0,5 mg/L BA. Lin và cộng sự (2000) báo cáo rằng mô sẹo toàn năng của một giống lai Paphiopedilum (P. callosum ” Oakhi ” P. lawrenceanum ” Tradition “) có thể được kích thích từ mầm đốt thân của hạt giống trên môi trường 1/2 MS bổ sung 1-10 mg/L 2,4-D và 0,1-1 mg/L TDZ trong bóng tối. Luan và cộng sự (2012) cũng báo cáo ở môi trường 1/2 MS bổ sung 10 mg/L 2,4-D và 0,1 mg/L TDZ là phù hợp nhất cho sự kích thích mô sẹo của P. delenatii và P. callosum. Trong nghiên cứu của Lin và cộng sự (2000), trên môi trường không có PGR, mô sẹo nuôi cấy cấp 2 cho thấy sự phát triển nhỏ và cuối cùng bị nâu và hoại tử. Các hiện tượng tương tự đã được quan sát thấy trong mô sẹo được duy trì trên môi trường chỉ chứa TDZ hoặc 2,4-D; các mô sẹo nuôi cấy cấp 2 bắt đầu tăng sinh và tăng trọng lượng, sau đó bị hóa nâu và hoại tử. Mô sẹo nuôi cấy trên môi trường chứa cả 2,4-D và TDZ tăng sinh tốt và sau đó được tái sinh trên môi trường được thiết lập để tái tạo cây con. Những môi trường được bổ sung với 5 mg/L 2,4-D và 1 mg/L TDZ đã được chọn làm môi trường duy trì tiêu chuẩn cho sự tăng sinh của mô sẹo toàn năng vì có tốc độ tăng trưởng tốt nhất. Mô sẹo toàn năng có thể phát triển trên môi trường duy trì này trong 3 năm mà không bị mất khả năng tái sinh chồi. Các mô sẹo đã phát triển, hình thành các PLBs và cuối cùng là các cây con mà có thể được chuyển vào chậu và phát triển tốt. Những mô sẹo nhỏ hình thành trên môi trường có chứa 1 mg/L 2,4-D hoặc 100 mg/L PBOA một mình, thì không tăng sinh và cuối cùng chết trong các lần nuôi cấy tiếp theo. Trong tất cả các sự kết hợp khác của PBOA và TDZ, đều không có sự hình thành mô sẹo. Chỉ một mình TDZ không thể kích thích mô sẹo. Tuy nhiên, những mẫu mô của thân, đầu rễ và lá của bất cứ cây lai Paphiopedilum nào (P. henryanum ‘# 19’ ‘P. philippinense’ ‘# 10’ ‘) cũng không tạo ra mô sẹo hữu hiệu khi được nuôi cấy trên các môi trường nói trên cũng như trên các môi trường nuôi cấy khác (Lin và cộng sự, 2000).
Hong và các cộng sự (2008) báo cáo rằng hạt giống từ quả nang xanh 5 tháng tuổi của một loài lan Maudiae, P. Alma Gavaert, có thể hình thành mô sẹo toàn năng trên môi trường 1/2 MS bổ sung với 22,60μM 2,4-D (5,0 mg/L) và 4,54 μM (1,0 mg/L) TDZ trong bóng tối. Mô sẹo được tăng sinh và duy trì mà không có bất kỳ hình thái học nào khác trên cùng một môi trường với khoảng thời gian 2 tháng nuôi cấy cấp 2 trong hơn 2 năm.
Ng & Saleh (2011) báo cáo sự kích thích của mô sẹo từ các mẫu mô đốt thân của của cây con P. rothschildianum in vitro được nuôi cấy trên 1/2 MS bổ sung 4 μM (0,86 mg/L) Kn và 2 g/L peptone. Các mô sẹo được kích thích có thể tăng sinh và hình thành PLBs từ bề mặt của mô sẹo tăng sinh khi được nuôi cấy cấp 2 trên cùng một môi trường. Số lượng trung bình cao nhất của PLB thứ cấp được tạo thành trên môi trường 1/2 MS bổ sung 4.0 μM (0.86 mg/L) Kn là 4.1 PLBs/ mẫu mô sau 8 tuần nuôi cấy. Ngược lại, việc bổ sung BA đã ức chế sự kích thích của sự hình thành PLB thứ cấp. PLBs thứ cấp tiếp tục tăng sinh và hình thành 9.5-12.1 PLBs/PLB thứ cấp sau khi nuôi cấy lần 2 trên môi trường 1/2 MS không PGR được bổ sung với 60 g/L BH.
Ng & Saleh (2011) đã thử nghiệm môi trường 1/2 MS với các nồng độ khác nhau của BH, PH và TH (tương ứng 15, 30, 45 hoặc 60 g/L) hoặc 5, 10, 15 và 20% CW trên sự hình thành PLB. Ở nồng độ 20% (v/v) CW là sự bổ sung hữu cơ hiệu quả nhất để tạo điều kiện cho sự hình thành PLB ở P. rothschildianum và sự biệt hóa thành các cây con sau đó.
Nhân chồi
Các PGR bao gồm auxin (2,4-D và NAA), cytokinin (BA, TDZ, zeatin và Kn) và các hợp chất khác như 2iP được sử dụng để nhân chồi. Huang (1988) đã báo cáo rằng chồi bất định và cây con có thể phát triển từ những đỉnh chồi của giống lai Paphiopedilum (P. philippinense P. Susan Booth) in vitro và môi trường MS bổ sung với 3.0 mg/L 2iP, 0.1 mg/L NAA, 30 mg/L adenine sulfate và 15% CW có hiệu quả cho sự hình thành và phát triển các mẫu mô vô trùng, trong khi môi trường MS có bổ sung 100 mg/L BA (mức BA này là độc đối với hầu hết các cây) có thể được dùng để nhân chồi bằng cách gia tăng phân nhánh ở nách (Huang, 1988, Wu và cộng sự, 2012).
Huang và cộng sự (2001) phát hiện ra rằng TDZ không hiệu quả hơn BA cho sự tăng sinh chồi và sự hình thành rễ của ba giống lai Paphiopedilum (P. philippinense x P. Susan Booth, P. bellatulum ” Big spot ” x P. Jo Ann Wine, P. micranthum x P. Glaucophyllum). Số lượng chồi giống lai Paphiopedilum tăng gấp đôi mỗi 12 tuần khi xử lý với 13 µM (2.93 mg/L) BA và NAA 1.6 µM (0.3 mg/L), trong khi đó TDZ ức chế sự tang sinh chồi của các giống lai tương tự. NAA cũng không có lợi cho sự hình thành chồi, nhưng hơi ức chế khi ở nồng độ cao nhất (1.0 mg/L).
Chen và cộng sự (2002) báo cáo rằng môi trường nuôi cấy 1/2 MS được bổ sung TDZ nồng độ 0.45 hoặc 4.45 µM (0.1 hoặc 1.0 mg/L), hoặc 4.52 hoặc 45.25 µM (1.0 hoặc 10.0 mg/L) 2,4-D, một mình hoặc kết hợp, có thể kiểm soát sự phát triển của quá trình nhân chồi từ các mẫu mô đốt thân của giống lai P. philippinense (PH59, PH60). Môi trường 1/2 MS bổ sung với sự kết hợp của 4.52 µM (1.0 mg/L) 2,4-D và 0.45 µM (0.1 mg/L) TDZ kích thích tỷ lệ phần trăm cao hơn của các mẫu mô với chồi và tăng số lượng chồi/mẫu mô nhiều hơn so với môi trường không có PGR ở giống lai PH59. Ở giống lai PH60, mặc dù tỷ lệ phần trăm của các mẫu mô tạo thành các chồi đã tăng lên đáng kể trên môi trường nuôi cấy 1/2 MS được bổ sung với 4.52 µM 2,4-D (1.0 mg/L) và 0.30 µM (0.1 mg/L) TDZ, số lượng chồi/mẫu mô cao nhất có thể đạt được với 4.52 µM (1.0 mg/L) 2,4-D, nhưng không có TDZ. Tuy nhiên, Luan và cộng sự (2012) cho thấy môi trường 1/2 MS được bổ sung 0.5 mg/L TDZ và 0.1 mg/L NAA là phù hợp nhất cho sự tăng sinh chồi nụ của P. delenatii và P. callosum.
Hong và các cộng sự (2008) đã báo cáo một quy trình thích hợp cho sự kích thích PLB của chúng tôi Gavaert từ mô sẹo có nguồn gốc từ hạt trên môi trường 1/2 MS với 2.69 µM (0.5 mg/L) NAA kết hợp với 0.45 µM (0,1 mg/L) TDZ. Khi chuyển sang môi trường 1/2 MS bổ sung NAA 26.85 µM (5.0 mg/L), trung bình đạt 4.4 PLB/chồi nụ được hình thành từ mỗi mẫu mô sau 120 ngày nuôi cấy. Nồng độ PGR thích hợp để nhân chồi là 4.65 µM (1.0 mg/L) Kn, mà trung bình có thể kích thích 3.0 chồi từ một chồi non duy nhất sau 60 ngày nuôi cấy.
Long và các cộng sự (2010) báo cáo rằng chiều dài và số lượng chồi của bốn loài Paphiopedilum spp. bị ảnh hưởng bởi nồng độ và sự kết hợp của cytokinin và auxins được thêm vào môi trường. Không có lợi thế bằng cách thay thế BA bằng TDZ cho kích thích sự hình thành chồi ở cả 4 loài. Một nồng độ BA tương đối cao làm tăng số lượng chồi ở P. villosum var. densissimum và P. armeniacum nhưng giảm số lượng chồi ở P. insigne. BA ở nồng độ 3.5 mg/L gây hoại tử lan rộng ở mẫu mô P. insigne. Cơ chế hình thành cơ quan cao nhất của Paphiopedilum spp. xảy ra với sự kết hợp khác nhau của cytokinin và auxin trong môi trường. Số lượng chồi cao nhất của P. armeniacum với 4.0 mg/L BA và 0.1 mg/L NAA, với 1.0 mg/L BA và NAA 0.5 mg/L đối với P. insigne, với 3.0 mg/L BA và 1.0 mg/L NAA hoặc với 6.0 mg/L BA và 0.1 mg/L NAA cho P. villosum var. densissimum và với 5.5 mg/L BA và 0.5 mg/L NAA cho P. bellatulum.
Nhut và các cộng sự (2007) đã báo cáo rằng TDZ kích thích ra chồi gây ra ở P. delenatii có hiệu quả hơn BA hoặc zeatin, với 75% các đoạn đốt thình thành các chồi khi nuôi cấy trên môi trường MS biến đổi bổ sung với 1.5 mg/L TDZ sau 30 ngày nuôi cấy. Khi các mẫu mô cấy được nuôi cấy trên môi trường MS biến đổi bổ sung với BA 2.0 mg/L hoặc 1.5 mg/L zeatin, 54.5 và 58% các mẫu mô, hình thành chồi tương ứng.
Liao và các cộng sự (2011) báo cáo rằng lát cắt ngang của các giống lai Paphiopedilum (P. Deperle và P. Armeni White) có thể kích thích chồi bất định và tái sinh thành toàn bộ cây trên môi trường MS biến đổi bổ sung với 4.43 µM (1.0 mg/L) BA và 4.52 µM (1.0 mg/L) 2,4-D, hoặc trên môi trường MS biến đổi bổ sung với 44.39 µM (10.0 mg/L) BA và 26.85 µM (5.0 mg/L) NAA. Liao và các cộng sự (2011) phát hiện ra rằng các phần của nụ hoa dài từ 1.5-3.0 cm P. Deperle có thể tạo ra chồi, nhưng chỉ có các phần của nụ hoa ≥ 2.5 cm từ P. Armeni White có thể tái sinh. Các quan sát bằng kính hiển vi cho thấy lá bắc nhỏ ở cuống hoa bao bọc một nụ hoa thu nhỏ mới mà phát triển thành nụ hoa hoàn chỉnh với các mô tương tự như mô phân sinh dạng vòm có thể dẫn đến sự kích thích của thực vật. Sự lặp lại mô hình này đã dẫn đến cấu trúc cụm hoa duôi bò cạp ở loài Paphiopedilum đa hoa, và không cho kết quả lặp lại như trên đối với một hoa đơn lẻ.
Nhut và các cộng sự (2005) báo cáo rằng trạng thái vật lý của môi trường (lỏng hoặc bán rắn) ảnh hưởng đáng kể đến sự hình thành chồi ở các cây con bị thương in vitro của P. delenatii. Khi không bị chìm hoàn toàn trong môi trường nuôi cấy, cây con bị thương có thể lấy thành phần dinh dưỡng và PGR dễ dàng hơn trong môi trường lỏng. Điều này đã kích thích sự biệt hóa của mô bị ảnh hưởng và kết quả là số lượng chồi/mẫu mô ra nhiều hơn từ những cây con bị thương in vitro của P. delenatii. Trong môi trường bán rắn có chứa NAA 0.5 mg/L, số lượng chồi được hình thành mới có xu hướng giảm (từ 2.3 đến 0 chồi/mẫu mô) khi nồng độ TDZ tăng lên (0.25-2.5 mg/L). Ngược lại, số lượng chồi được hình thành trong môi trường lỏng tăng lên (từ 1.2 đến 3.0 chồi/mẫu mô) đáng kể khi mức độ TDZ tăng lên. Kết quả cho thấy những ảnh hưởng của TDZ đối với các mẫu mô phụ thuộc đáng kể vào các tính chất vật lý của môi trường. Trên môi trường lỏng hoặc bán rắn chứa 0.5; 1.0 hoặc 3.0 mg/L TDZ, không có auxin NAA, ảnh hưởng của môi trường lỏng lên sự tái sinh chồi tốt hơn môi trường bán rắn. Khi TDZ được sử dụng ở mức 1.0 mg/L, số lượng chồi/mẫu mô được hình thành (5.2 chồi/mẫu mô) trong môi trường lỏng lớn gấp gần 5 lần so với môi trường bán rắn (1.1 chồi/mẫu mô) và lớn hơn hai lần (2.2 chồi/mẫu mô) so với môi trường có chứa auxin, cho thấy rằng auxin có thể đóng vai trò ức chế trong môi trường lỏng.
Nhut và các cộng sự (2005) thấy rằng không có chồi nào được hình thành trong kiểm soát việc xử lý với các chồi không bị thương trong ống nghiệm của cây con P. delenatii trong tất cả các loại môi trường thử nghiệm. Trung bình có 2.3 chồi khỏe mạnh thu thập được từ những cây con đã được nuôi cấy trên môi trường MS rắn có chứa 0.25 mg/L TDZ và NAA 0.5 mg/L, bước tạo vết cắt trên chồi là điều kiện tiên quyết cho sự hình thành chồi ở cây con. Các tế bào bị thương ở khu vực bị hư hỏng có thể đã phản ứng dễ dàng hơn với các tác nhân kích thích như PGRs nhất định có trong môi trường, cho phép biệt hóa thành những chồi bất định.
Ng và các cộng sự (2010) báo cáo rằng thể chồi có thể được kích thích thành công từ các mô đốt thân và mô chồi đơn của P. rothschildianum được nuôi cấy trên môi trường 1/2 MS không có PGRs và nitơ hữu cơ (kiểm soát). Số lượng thể chồi tăng thêm bằng cách bổ sung vào môi trường nuôi cấy với nitơ hữu cơ (peptone và tryptone-peptone). Số lượng chồi nhân nhiều nhất đã hình thành trên các mô đốt thân được nuôi cấy trên môi trường 1/2 MS và bổ sung 1.0 g/L peptone với trung bình 2.9 chồi/mẫu mô sau 16 tuần nuôi cấy; Tuy nhiên, số lượng chồi cao nhất được hình thành trên môi trường bổ sung với 2.0 g/L tryptone-peptone với trung bình 2.8 chồi hình thành trên mỗi mẫu chồi đơn. Ngược lại, peptone không kích thích hiệu quả sự hình thành thể chồi từ các mẫu chồi non, trừ ở nồng độ thấp (0.5 gg/L). Việc bổ sung một lượng peptone lớn hơn (1.0 và 2.0 g/l) đã ức chế sự hình thành thể chồi.
Kích thích rễ
Sự kích thích rễ dễ dàng đạt được trong quá trình nuôi cấy in vitro của Paphiopedilum, và có thể được thúc đẩy bằng cách bổ sung chất hữu cơ và/hoặc PGRs (Huang và cộng sự, 2001, Zeng và cộng sự, 2013). Hong và các cộng sự (2008) báo cáo rằng PGR thích hợp cho sự ra rễ là NAA 26.85 µM (5.0 mg/L). Huang và cộng sự (2001) thấy rằng sự ra rễ đã được tăng mạnh bởi 1.6 µM (0.3 mg/L) và NAA 5.4 mM (1.0 mg/L). Huang và cộng sự (2001) cũng báo cáo rằng CW và HC làm tăng sự hình thành rễ, 15% (v/v) CW và 1.0 g/L HC là phù hợp nhất. Sucrose là tốt hơn cho sự ra rễ so với maltose, sự ra rễ ít xảy ra ở tất cả các nồng độ maltose, trong khi sucrose tăng cường ra rễ ở 0.18 M (62 g/L), nhưng đã ức chế ra rễ ở nồng độ cao hơn (0.26 M hoặc 89 g/L).
Thiết lập chế độ chăm sóc ex vitro và vườn ươm
Các bình nuôi cấy có chứa cây con hoặc cây con Paphiopedilum vi nhân giống in vitro thường được chuyển sang điều kiện tự nhiên từ buồng nuôi cấy trong khoảng 1-2 tuần trước khi chúng được đưa ra vườn ươm, mà có thể tăng khả năng thích ứng với môi trường bên ngoài, điều này rất hữu ích cho các dự án đưa loài lan Paphiopedilum trở lại tự nhiên (Chen và cộng sự, 2004b, Zeng và cộng sự, 2012). Các môi trường nuôi cấy cho lan thường bao gồm những viên gạch vỡ, đá núi lửa, rong rêu, than bùn, đá Zhijing (có tính chất giữ nước tốt hơn đá bình thường), vỏ cây và các môi trường hỗn hợp khác. Trong môi trường nhà kính có độ ẩm không khí cao, khoảng 60% cây con P. villosum var. Densissimum sống sót trên nền giá thể than bùn với rêu (Long et al., 2010). Zeng và các cộng sự (2012) báo cáo rằng môi trường hỗn hợp [2 : 1 : 1 (v/v) đá Zhijing : than bùn: vụn vỏ cây] phù hợp hơn cho việc nuôi cấy cây con P. wardii hơn là giá thể chỉ chứa rêu, than bùn hoặc đá Zhijing, có khả năng duy trì đồng thời độ ẩm và không khí (Hình 1K).
Nơi tốt nhất để bảo tồn nguồn gen thực vật và để thúc đẩy đa dạng sinh học là trong tự nhiên (McNaughton, 1989, Zeng và cộng sự, năm 2015). Việc đưa trở lại tự nhiên các loài bản địa ngày càng trở nên quan trọng trong công tác bảo tồn trên toàn thế giới để phục hồi các loài quý hiếm (Rout et al., 2009). Cây con Paphiopedilum wardii đã được đưa ra vườn ươm thành công và đưa trở lại môi trường tự nhiên và môi trường sống trong rừng khác (Zeng et al., 2012). Tỷ lệ sống sót cao nhất (65%) ở môi trường rừng Ehuangzhang hơn là ở môi trường núi Gaoligong, có thể do chiếu xạ, đất, nước, chất dinh dưỡng, độ ẩm môi trường và các yếu tố khác trong quá khứ. Hai năm sau khi tái sinh, 32% cây có hoa đã nhảy con và tạo hạt giống, nhưng không có cây nào nhảy con và ra hạt trong hai môi trường sống trong rừng khác, có thể là do sự thiếu thụ phấn phù hợp (Hình 1L, Zeng et al, 2012).
Kết luận và triển vọng trong tương lai
Các đặc tính của cây trồng phải được dự đoán và thống nhất để có thể thương mại hóa trên quy mô lớn, nhưng các đặc điểm của các mầm đốt thân và cây con in vitro của giống lai Paphiopedilum là rất khác nhau và không thể đoán trước, điều này không thể chấp nhận được trong sản xuất thương mại (Liao và cộng sự, 2011). Hiện nay, có rất ít quy trình cho việc nuôi cấy mô Paphiopedilum từ mẫu cấy mô của cây trưởng thành, trong những loài Paphiopedilum và cây lai vẫn là cây duy nhất được trồng thương mại mà không được nhân bản bởi vì các mẫu cấy mô từ cây trưởng thành của các loài Paphiopedilum thì không kích thích tạo chồi và tái sinh cây (Arditti, 2008) hoặc vì rất khó để có được các phôi vô trùng từ các cây trưởng thành thông qua các bước khử trùng bề mặt bình thường để nuôi cấy in vitro do các vi khuẩn nội sinh (Chugh và cộng sự, 2009). Do đó, trong tương lai, điều quan trọng là phải tiếp tục cải tiến các phương pháp nuôi cấy mô in vitro của Paphiopedilum, bao gồm việc sử dụng các phôi vô trùng từ cây trưởng thành và tăng tốc độ nhân giống và tăng trưởng của Paphiopedilum (Liao và cộng sự, 2011).
Các quy trình khử trùng mẫu mô cấy có thể ảnh hưởng đến thành công của sự vô trùng và chất lượng tiếp theo và phát sinh cơ quan của mẫu mô cấy. Chọn lựa nguồn mẫu cấy thích hợp, sử dụng và chuẩn bị một mẫu cấy tối ưu, lựa chọn một chất khử trùng thích hợp và áp dụng một quy trình thích hợp có thể thành công trong việc làm giảm sự xâm nhiễm trong nuôi cấy in vitro. Các chiến lược trước in vitro cho cây được chọn làm mẫu cấy trong vườn hoặc nhà kính, bao gồm việc kiểm soát phân bón, tưới nước, bảo dưỡng thực vật và bệnh tật và dịch hại có thể có hoặc tạo ra các nguồn mẫu mô cấy có tính tái tạo cao (Winarto et al., 2013). Ở Paphiopedilum, cần phải có một nghiên cứu có hệ thống về bước khử trùng các mẫu mô cấy.
Bioreactor, do hiệu quả cao của chúng (Ziv, 2005), đã được áp dụng để nhân giống một vài loài lan, bao gồm Phalaenopsis( Hồ Điệp) (Park et al., 2000) và Oncidium ‘Sugar Sweet’ (Yang và các cộng sự, 2010). Tuy nhiên, chưa có báo cáo nào áp dụng cho Paphiopedilum. Môi trường lỏng trong bioreactor cho phép tiếp xúc gần với mô kích thích và tạo thuận lợi cho sự hấp thu các chất dinh dưỡng và PGR, dẫn đến sự phát triển tốt hơn của chồi và rễ. Việc lắc liên tục thúc đẩy sự giảm biểu hiện của ưu thế đỉnh và thông khí dẫn tới sự kích thích và tăng sinh của chồi nách và đồng thời tăng trưởng nhanh hơn (Mehrotra và cộng sự, 2007), điều này có thể làm tăng hiệu quả sự nhân giống và tăng trưởng. Ngoài ra, sự kiểm soát chặt chẽ hơn của sự hình thành cơ quan có thể xảy ra nếu các lớp tế bào mỏng thu được từ các mầm đốt thân có nguồn gốc hạt được sử dụng (Teixeira da Silva, 2013b). Việc sử dụng các từ trường vĩnh cửu cũng có thể là một cách sáng tạo để kích thích sự hình thành cơ quan ở Paphiopedilum và đã thành công trong nuôi cấy mô ở Cymbidium và Phalaenopsis (Van cộng sự, 2011, 2012).
Một số phương pháp công nghệ sinh học mới cho việc nhân giống in vitro và tăng trưởng cho lan, ví dụ như phương pháp làm giàu CO2 (Norikane và cộng sự, 2010) hoặc các hệ thống chiếu sáng luân phiên [diodes phát quang (đèn LED)/đèn huỳnh quang âm cực lạnh (CCFLs); Cybularz-Urban và các cộng sự, 2007; Godo và cộng sự, 2011; Tanaka và cộng sự, 1998] hoặc là sự kết hợp cả hai (Norikane và cộng sự, 2013), có thể tạo điều kiện nảy mầm hạt giống và kích thích tạo sinh khối ở hoa lan, điều này có thể rất hữu ích cho việc nhân giống in vitro Paphiopedilum do tốc độ nhân giống in vitro và tăng trưởng chậm của Paphiopedilum. Tuy nhiên, vẫn chưa có báo cáo về phương pháp sử dụng đèn LEDs và làm giàu CO2 được áp dụng trên nuôi cấy in vitro của Paphiopedilum.
Thông tin liên hệ
SBC Scientific Hotline: 0945677929 Email:[email protected]
Oleh Nuôi Cấy Mô Thực Vật
Nảy Mầm Và Phát Triển Invitro Loài Lan Hài Paphiopedilum Spicerianum
Ying Chen a,b,c, Uromi Manage Goodale a,b,d, Xu-Li Fan a,b, Jiang-Yun Gao a,b,∗
a
Phòng thí nghiệm Trọng điểm về Nguồn tài nguyên Thực vật Nhiệt đới và sử dụng bền vững, Vườn Bách thảo Nhiệt đới Xishuangbanna, Học viện Khoa học Trung Quốc, Mạnh Giai, Vân Nam 666303, Trung Quốc
b
Trung tâm Bảo tồn Tổng hợp, Vườn Bách thảo Xishuangbanna, Học viện Khoa học Trung Quốc, Mạnh Giai, Vân Nam 666303, Trung Quốc
c
Đại học Cao học của Viện Hàn lâm Khoa học Trung Quốc, Bắc Kinh 100049, Trung Quốc
d
Tổ chức Sinh thái học và Nhóm Sinh thái thực vật, Phòng thí nghiệm trọng điểm về Bảo tồn và Sử dụng Tài nguyên Sinh học cận nhiệt đới của Trường Đại học Lâm nghiệp, Đại học Quảng Tây, Daxuedonglu 100, Nam Ninh 530005, Quảng Tây, Trung Quốc
Nhận bài: 29/11/2014 Nhận phản biện: 5/1/2015
Nhận đăng: 5/1/2015 đăng online 20/1/2015
Paphiopedilum spicerianum nằm trong danh sách một trong những loài thực vật hoang dã với quần thể rất nhỏ (PSESP). Quy trình cho nảy mầm không cộng sinh (nảy mầm in vitro) và phát triển cây con in vitro nhằm mục đích sản xuất cây con để trả về tự nhiên. Tỉ lệ nảy mầm cao nhất đạt được ở RECW với chu kì nuôi 24 giờ tối sau khi xử lý với 1% NaOCl khoảng 40 phút và nảy mầm sau 30 ngày. Tuy nhiên, protocorm của chúng có màu trắng và không phát triển được nữa. Trong cùng điều kiện nuôi cho nảy mầm, MSCW có tỉ lệ nảy mầm thấp hơn nhưng protocorm lại xanh và khỏe hơn. Trong 4 môi trường thử nghiệm hình thành cây, thì môi trường Hyponex No 1 với 1.0 mg/L α-naphthalene acetic acid, 0.5 g/L than hoạt tính và 10% dịch chiết chuối banana có hiệu quả nhất. Cây con phát triển vượt trội trong 6 môi trường thủ nghiệm trong 4 tháng, với tốc độ phát triển lá cao nhất ở cả 6 môi trường sử dụng cho nuôi cây, có bổ sung 1.0 mg/L 6-benzyladenine để thúc đẩy lá phát triển. Thử nghiệm Fluorescein diacetate (FDA) trên hạt cho thấy nồng độ cao của muối này trong môi trường và thời gian tiếp xúc lâu hơi với NaOCl làm giảm sự nảy mầm bởi vì chúng gây tổn thương lên vỏ hạt và tế bào phôi.
Từ khóa: Bảo tồn hoa lan, Paphiopedilum spicerianum , PSESP đối với cây con ở Trung Quốc, Phát triển hạt, Sự nảy mầm của hạt, Khử trùng hạt
1.
Giới thiệu
Việc bảo tồn các loài thực vật quý hiếm và bị đe dọa bằng phương pháp nhân giống in vitro cũng tương tự như các loài khác, nhưng cần được khắc phục những thách thức do hạn chế số lượng vật liệu để nuôi cấy (Fay, 1992; Sarasan và cộng sự, 2006). Trong phát triển các phương pháp nuôi cấy in vitro đối với các loài thực vật có tầm quan trọng bảo tồn, thì việc sử dụng hạt giống phù hợp hơn so với các phương pháp nuôi cấy mô tế bào khác, bởi vì chúng cho phép duy trì một cơ sở di truyền rộng lớn hơn. Trong nghiên cứu này tôi báo cáo về những thử nghiệm nhanh và đáng tin cậy, có thể được sử dụng để đánh giá sự phù hợp của môi trường nuôi cấy mô, trong quy trình cho nảy mầm và phát triển cây con từ hạt, lên loài lan đang bị đe dọa nguy cấp Paphiopedilum spicerianum (H.G. Reichenbach).
Các thử nghiệm như thế này cần ít hạt giống vì thế cho phép các nhà bảo tồn tiết kiệm được nguồn hạt giống hạn chế của các loài cây, chỉ có thể tái khai thác trong tự nhiên (Stewart, 2008; Swarts và Dixon, 2009; Ren và cộng sự, 2012).
Paphiopedilum spicerianum được tìm thấy từ phía bắc Ấn Độ đến phía nam Vân Nam, Trung Quốc và Myanmar, và được khai thác rất nhiều để trồng trong vườn cảnh trong những năm gần đây (Liu và cộng sự, 2009). Ở Trung Quốc, có có 1 quần thể đơn lẻ khoảng 10 cá thể trưởng thành được tìm thấy vào năm 2006 ở Phổ Nhĩ, Vân Nam (Ye và Luo, 2006). Đây là những loài thực vật mọc dưới đất ở sườn dốc ven bờ sông (Hình 1a ) và môi trường sống bị đe dọa nghiêm trọng bởi việc độc canh đồn điền cà phê. Là một thành viên trong họ Orchidaceae, P. spicerianum được bảo vệ trong Phụ lục I của Công ước về Thương mại Quốc tế các loài động thực vật hoang dã nguy cấp (CITES, 2013) và nằm trong 38 loài lan ở Trung Quốc nằm trong “Chương trình bảo tồn thực vật hoang dã có quần thể rất nhỏ” ((PSESP; (State Forestry Administration of China, 2012)). Trả về tự nhiên là ưu tiên hàng đầu trong chiến lược bảo tồn đối với các loài thực vật PSESP, là những loài mà có số lượng quần thể rất ít do sự can thiệp nghiêm trọng của con người trong thời gian gần đâu và do sự đào thải tự nhiên các loài quý hiếm (Cục Quản lý lâm nghiệp Trung Quốc, 2012; Ren và cộng sự, 2012; Ma và cộng sự, 2013).
Hình 1. P. spicerianum trong tự nhiên có hoa, quả, hạt và cây được phát triển từ hạt nảy mầm in vitro sẵn sàng để đưa về tự nhiên. (a) P. spicerianum trên mặt đất phủ trên vách đá trong tự nhiên. (b) Hoa của P. spicerianum từ cây trồng ở vườn ươm XBTG. (c) Quả chín của P. spicerianum vào 365 DAP. (d) Hình chụp hạt P. spicerianum dưới kính hiển vi điện tử. (e) và (f) Cây con sau giai đoạn protocorm được cấy chuyền vào môi trường có Hyponex No 1 với 1.0 mg/L α-naphthalene acetic acid, 0.5 g/L than hoạt tính và 10% dịch chiết chuối, lần lượt ở khoảng 1 tháng và 3 tháng. (g) Cây con được trồng ra đất chuẩn bị đưa về tự nhiên.
Do đặc tính sinh học chuyên biệt, nên rất khó để cho các hạt giống hoa lan nảy mầm và có được đủ cây con để trồng cây trong tự nhiên. Mặc dù năm 1922 Knudson đã khám phá ra cách làm cho hạt lan nảy mầm mà không cần có sự cộng sinh, và phương pháp này đã cho nảy mầm thành công ở nhiều loài thực vật giúp cho công tác bảo tồn nhiều loài lan bị đe dọa nguy cấp (Sgarbi và cộng sự, 2009; Mohanty và cộng sự, 2012). Phương pháp cho nảy mầm không cộng sinh in vitro phải được phát triển tùy vào mỗi loài bởi vì điều kiện nuôi cấy mô ở mỗi bước có sự đặc thù cho từng loài (Arditti, 1967; Zeng và cộng sự, 2013). P. spicerianum thuộc phân họ Cypripedioideae, được biết đến là rất khó nảy mầm (Arditti, 1967; Kauth và cộng sự, 2008; Zeng và cộng sự, 2013).
Nảy mầm in vitro có thành công hay không phụ thuộc vào điều kiện của hạt, chẳng hạn như độ chín của vỏ quả và nguồn gốc, cũng như là điều kiện vật lí cho nảy mầm và thành phần trong môi trường phát triển (Arditti, 1967; Kauth và cộng sự, 2008; Zeng và cộng sự, 2013). Ở chi Paphiopedilum, ảnh hưởng của độ chín của vỏ quả (được xác định theo số ngày sau khi thụ phấn –DAP) lên sự nảy mầm thành công giữa các loài (Lee, 2007; Long và cộng sự, 2010). Việc thụ phấn chéo ở Paphiopedilum cho thấy hạt giống có khả năng nảy mầm cao hơn so với hạt có được thông qua việc tự thụ phấn (Stimart và Ascher, 1981). Hơn nữa, các điều kiện môi trường tăng trưởng như thành phần, nguồn carbon, các chất điều sinh trưởng thực vật, các chất bổ sung tự nhiên, (Chen và cộng sự, 2004a, b, Long và cộng sự, 2010), thời gian khử trùng hạt (Lee, 2007) và ánh sáng (Stimart và Ascher, 1981) cũng có thể ảnh hưởng đáng kể đến sự nảy mầm thành công của các loài Paphiopedilum. Mất nhiều thời gian và nguồn lực để phát triển được quy trình cho nảy mầm in vitro đối với các loài đang bị đe dọa, và khả năng thử nghiệm các điều kiện tốt nhất thì rất giới hạn đối với các hạt giống của chúng.
Ở vườn bách thảo nhiệt đới Tây Song Bản Nạp (Xishuangbanna Tropical Botanical Garden –XTBG), Vân Nam, Trung Quốc, một phần của dự án bảo tổng hợp tập trung vào việc ngăn chặn sự tiệt chủng của các loài lan quý hiếm và có nguy cơ bị tuyệt chủng, chúng tôi phát triển quy trình cho nảy mầm in vitro cho loài P. spicerianum. Chúng tôi đã thử nghiệm xem môi trường nào thích hợp cho mỗi giai đoạn nảy mầm bằng cách thử nhiều thành phần môi trường, thời gian khử trùng với NaOCl 1%, và ánh sáng. Dựa vào những nghiên cứu trước đây đối với loài Paphiope-dilum, và qua những thử nghiệm sơ bộ, chúng tôi cho rằng sự nảy mầm cao nhất sẽ xảy ra ở môi trường MS (Murashige and Skoog, 1962) có bổ sung nước dừa (Chen và cộng sự, 2002, 2004a, b; Zeng và cộng sự, 2012), trong điều kiện tối (Pierik và cộng sự, 1988), và được khử trùng với NaOCl 1% khoảng 60 phút (Lee, 2007). Chúng tôi đã thử nghiệm trên 4 môi trường trong lần cấy đầu tiên để hình thành cây và 6 môi trường cho sự phát triển về sau. Trong khi quy trình được phát triển chúng tôi sử dụng kỹ thuật chụp ảnh dưới kính hiển vi điện tử quét (scanning electron microscopic techniques )và phương pháp nhuộm bằng Fluorescein Diacetate (FDA) để xác định ảnh hưởng của điều kiện thử nghiệm đến lớp vỏ hạt và sự toàn vẹn phôi. Nghiên cứu này lần đầu báo cáo về các thử nghiệm toàn diện theo kinh nghiệm để phát triển quy trình nảy mầm in vitro cho P. spicerianum, kết hợp với nhuộm và kỹ thuật chụp ảnh, có thể ứng dụng rộng rãi cho các loài quý hiếm và có nguy cơ bị tiệt chủng khác.
2.
Vật liệu và phương pháp
2.1
Vật liệu từ cây P. spicerianum và lựa chọn hạt giống
P. spicerianum (Hình 1a) là hình ảnh nơi ẩm ướt và có bóng mát của đất phủ trên các mỏm đá trong rừng tại cao độ 900 và 1400 m (Liu và cộng sự, 2009). Ra hoa trong tự nhiên từ tháng 9 đến tháng 10, và quả chín sau 11 tháng đến 1 năm kể từ khi được thụ phấn (Liu và cộng sự, 2009). Tháng 9/2012, 38 cây được tìm thấy ở Phổ Nhĩ, phía nam Vân Nam, 18 cây được thu để bảo tồn in situ tại vườn XTBG. Tháng 11/2012, sự thụ phấn chéo đã được thực hiện giữa 3 cá thể đã nở hoa tại vườn XTBG (Hình 1b) và tháng 10/2013, 2 quả chín sắp nứt ra có vỏ chuyển sang màu nâu (365 DAP) (Hình 1c) được thu hoạch. Sau đó đem hạt khử quả và cho nảy mầm. Hạt được kiểm tra tính khả thi bằng thử nghiệm FDA như sau: hạt được ngâm trong 1% NaOCl khoảng 15 phút và rửa lại 2 lần bằng nước khử ion, giữ trong nước khoảng 16 giờ, lặp lại 4 lần, trong ống tiêm có vải nilon đường kính lỗ 45 µm. Hạt ở mỗi lần lặp lại được đặt vào kính hiển vi và được trộn theo tỉ lệ 1:1 với 0.5% (w/v) FDA hòa trong aceton. Để phản ứng khoảng 15 phút để tích lũy fluorescein trong tế bào sống (Clarke và cộng sự, 2001). Hạt được kiểm tra dưới kính hiển vi UV-fluorescence (LSM710 ImagerZ2, Zeiss, Đức) để kiểm tra tình trạng vỏ ngoài và khả năng sống của phôi (Copeland and McDonald, 2001). Các hạt tươi không xử hóa chất, có hình ảnh ở Hình 1d, sử dụng kính hiển vi điện tử quét (a scanning electron microscope) (EVO LS10, Zeiss, Đức). Các thí nghiệm về sau trên hạt đã thu hoạch được tiến hành trong phòng nuôi cấy mô ở điều kiện vô trùng ở 25 ± 2.0°C và độ ẩm tương đối 45%.
2.2 Đánh giá sơ bộ về các thành phần môi trường phù hợp cho sự nảy mầm (giai đoạn 1)
2.3
Đánh giá thứ phát về các điều kiện ánh sáng và các thử nghiệm phù hợp cho nảy mầm, hình thành và phát triển protocorm (giai đoại 1 – 3)
Theo như đánh giá sơ bộ ban đầu (xem phần kết quả), hai môi trường ¼ MS cải tiến bổ sung 10% CW và RE cải tiến với 1.0 g/L than hoạt tính và 10% CW, được lựa chọn để đánh giá ảnh hưởng ánh sáng (chu kì sáng tối 12/12 giờ so với chu kì 24 giờ tối) và thời gian khử trùng ( 1% [w/v] NaOCl khoảng 0, 40, 60 hoặc 80 phút) đối với sự nảy mầm, hình thành và phát triển protocorm. Một bộ hạt đã được khử trùng, 4 lần lặp lại cho mỗi nghiệm thức khử trùng, được đánh giá sức sống bằng sử dụng thử nghiệm FDA được mô tả như ở trên và so sánh với hạt không được khử trùng. Tất cả các thử nghiệm được quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang UV (LSM710, ImagerZ2, Zeiss, Đức). Một bộ hạt khác được chuyển vào môi trường sử dụng cùng phương pháp như trên, mỗi thử nghiệm lặp lại 15 chai (15 chai, mỗi chai 200 mL vô trùng chứa khoảng 100 hạt), hạt được cho nảy mầm trong cùng điều kiện phòng nuôi cấy như trên. Sau khi chuyển hạt vào chai, số lượng chính xác của hạt được đếm dưới kính hiển vi. Việc nuôi cấy với 24 giờ tối được thực hiện bằng cách bao bọc các chai nuôi cấy bằng vải đen. Hạt nảy mầm, hình thành và phát triển protocorm được đánh giá sau 40, 70 và 90 ngày gieo hạt. Chúng tôi định nghĩa sự hình thành protocorm (giai đoạn 2) là khi mở rộng phôi và nứt vỏ, phát triển protocorm (giai đoạn 3) là khi xuất hiện mô phân sinh non (promeristem) (Arditti, 1967).
2.4
Đánh giá môi trường phù hợp để hình thành cây con (giai đoạn 4)
Sau 90 ngày, các protocorm xanh đã phát triển trong các thử nghiệm trên được sử dụng để kiểm tra khả năng hình thành cây trong 4 môi trường: (1) ½ MS cải tiến với 0.2 mg/L indole-3-butylic acid (IBA) và 2.0 g/L than hoạt tính; (2) 3.0 g/L Hyponex No.1 (Hyponex Corporation, Mỹ) với 1.0 g/L NAA, 0.5 g/L than hoạt tính và 10% dịch chiết chuối; (3) MS cải tiến với 1.0 mg/L NAA, 0.2 mg/L IBA, 0.5 g than hoạt tính và 10% dịch chiết chuối; (4) 2.0 g/L Hyponex No.1 với 2.0 g/L peptone, 1.0 mg/L NAA, 1.0 g/L than hoạt tính và 10% dịch chiết chuối. Protocorm được chuyền sang chai 200 mL vô trùng trong điều kiện vô trùng và mỗi nghiệm thức có 15 chai, mỗi chai 3 protocorm. Protocorm được nuôi trong điều kiện 12 giờ sáng và 12 giờ tối. Sự hình thành cây con (giai đoạn 4), được định nghĩa là có lá đầu tiên xuất hiện (Arditti, 1967), được đánh giá sau 2 tháng sinh trưởng và sống sót của cây.
2.5
Đánh giá điều kiện phù hợp cho cây con tăng trưởng (giai đoạn 5)
Cây con đã phát triển được đánh giá sâu hơn trong giai đoạn tăng trưởng trong 6 môi trường: (1) MS cải tiến với 0.2 mg/L NAA, 2.0 mg/L 6-BA và 2.0 g/L than hoạt tính; (2) 3.0 g/L Hyponex No.1, 0.5 mg/L NAA và 1.0 g/L than hoạt tính; (3) 3.0 g/L Hyponex No 1, 2.0 mg/L 6-BA, 0.5 mg/L NAA và 1.0 g/L than hoạt tính; (4) MS cải tiến với 0.2 mg/L IBA, 0.2 mg/L 6-BA và 2.0 g/L than hoạt tính; (5) 3.0 g l−1 Hyponex No.1, 3.0 g/L peptone, 0.2 mg/L NAA, 2.0 mg/L 6-BA và 1 g/L than hoạt tính; (6) 3.0 g/L Hyponex No.1, 1.0 mg/L NAA, 1.0 mg/L 6-BA, 0.5 g/L than hoạt tính và 10% dịch chiết chuối. 3 cây con được chuyển vào mỗi chai 200 mL vô trùng trong điều kiện vô trùng và mỗi nghiệm thức lặp lại 8 chai. Ảnh hưởng của những môi trường này lên sự tăng trưởng của cây con (giai đoạn 5) được đánh giá thông qua tốc độ phát triển chiều dài và chiều rộng lá. Chúng tôi không đánh giá sinh khối bị hủy hoại bởi vì tất cả cây con đều được đưa về cho các thử nghiệm trong tự nhiên (hình 1g)
2.6
Đánh giá ảnh hưởng của nồng độ muối cao đến cấu trúc hạt và tính toàn vẹn tế bào
Khi kết thúc các thí nghiệm chúng tôi tiến hành các kiểm tra xa hơn bởi vì hạt có thể nảy mầm nhiều hơn đáng kể ở môi trường có nồng độ thấp hơn. Hạt được xử lý với 1% NaOCl khoảng 40 phút và rửa hai lần bằng nước khử ion tiệt trùng và được ngâm trong một trong 3 nghiệm thức sau: ¼ MS, MS và RE, mỗi nghiệm thức lập lại 4 lần. Sau 16 giờ ngâm, hạt được kiểm tra bằng thử nghiệm FDA được mô tả như ở trên và quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang UV (LSM710 ImagerZ2, Zeiss, Đức).
3.
Phân tích thống kê
Chúng tôi không tiến hành phân tích thống kê đối với các thử nghiệm sơ bộ ban đầu về sự phù hợp thành phần môi trường cho nảy mầm (giai đoạn 1), bởi vì sự nảy mầm và hình thành protocorm chỉ diễn ra ở hai môi trường và cả hai môi trường này được lựa chọn để phân tích sâu hơn.
Số ngày sau khi gieo hạt (ngày 40 70 90 Nhân tố Thời gian khử trùng (df = 3) Môi trường (df = 1) Ánh sáng (df = 1) Thời gian khử trùng × Môi trường (df = 3) Thời gian khử trùng × Ánh sáng (df = 3) Môi trường × Ánh sáng (df = 1) Thời gian khử trùng × Môi trường × Ánh sáng (df = 3) 578.62*** 284.57*** 91.88*** 170.08*** 37.04*** 17.57** 0.12 ns 1212.13*** 522.00*** 135.08*** 292.44*** 51.65*** 37.80*** 1.29 ns 1219.90***522.08***137.60***304.03***49.14***36.35*** 1.10 ns ** P < 0.01.
*** P < 0.0001.
Đối với những đánh giá thứ phát về điều kiện cho nảy mầm, hình thành và phát triển protocorm (giai đoạn 1 – 3), chúng tôi đếm số hạt mà đạt đến hoặc trải qua giai đoạn phát triển protocorm trong mỗi thử nghiệm, xem như thành công (mã hóa là 1). Những hạt không đạt đến giai đoạn này xem như thất bại (mã hóa là 0). Chúng tôi kiểm tra có phải môi trường, ánh sáng và thời gian khử trùng và tương tác giữa 3 nhân tố nhà làm ảnh hưởng đến xác suất thành công đạt đến hoặc trải qua giai đoạn hình thành protocorm hay không, bằng sử dụng mô hình tuyến tính tổng quát (Sileshi, 2012) với hàm phân phối nhị phân trong gói epicalc phần mềm R (version 3.1.1 R Development Core Team, 2011). Chúng tôi tiến hành so sánh để kiểm tra sự khác biệt sau khi điều chỉnh alpha ở 0.05 (Bretz và cộng sự, 2010) sử dụng Turkey test trong gói mvtnorm và multcomp của phầm mềm R.
Bởi vì sự hình thành cây (giai đoạn 4) chỉ thành công ở một trong 4 môi trường thử nghiệm nên chúng tôi không tiến hành phân tích thống kê đánh giá điều kiện thích hợp cho phát triển cây. Đối với đánh giá điều kiện phù hợp cho sự tăng trưởng của cây, chúng tôi tính toán tốc độ phát triển chiều dài lá tương đối (RLLGR): RLLGR = (LLn/LL0)/t, trong đó LLo là chiều dài lá của cây tại thời điểm kết thúc đo đạc và LLn là chiều dài lá tại thời điểm kết thúc thí nghiệm, và t là thời gian trôi qua. Tốc độ tăng trưởng chiều rộng lá tương đối được tính toán theo (RLWGR): RLWGR = (LW n/LW 0)/t, trong đó LWo là chiều rộng lá của cây tại thời điêm đo cuối cùng, LWn là chiều rộng lá tại thời điểm kết thúc thí nghiệm, t là thời gian trôi qua. Đối với phân tích sử dụng RLLGR và RLWGR như là biến đáp ứng, chúng tôi sử dụng mô hình hồi quy tuyến tính hỗn hợp tổng quát cho các dữ liệu không cân bằng (vài thử nghiệm bị nhiễm nấm và phải bỏ đi) sử dụng gói Ime4 trong R, trong đó môi trường là yếu tố cố định còn sự lặp lại của các chai có sự tăng trưởng là yếu tố ngẫu nhiên. Trong khuôn khổ của mô hình được bố trí, bậc tự do đơn được tính toán bằng Turkey test điều chỉnh (alpha = 0.05) để so sánh giữa các môi trường, sử dụng gói mvtnorm và multcomp của phần mềm R.
4.
Kết quả
4.1
Vật liệu từ cây P. spicerianum và lựa chọn hạt giống
Các thử nghiệm kiểm tra sức sống đối với hạt tươi cho thấy trung bình 51.5 ± 6.3% hạt chứa phôi có khả năng sống, được đánh giá thông qua sự phát huỳnh quang xanh trong tế bào sống trong vỏ và phôi.
4.2 Đánh giá sơ bộ về các thành phần môi trường phù hợp cho sự nảy mầm (giai đoạn 1)
Trong những thử nghiệm sơ bộ ban đầu sử dụng 6 môi trường chúng tôi có thể cho hạt nảy mầm đầy đủ trong môi trường ¼ MS bổ sung 10% CW (79 ± 8% hạt nảy mầm), và môi trường RE cải tiến với 1.0 g/L than hoạt tính và 10% CW (57 ± 8% hạt nảy mầm). Tất cả môi trường RE còn lại đều làm cho hạt nảy mầm nhưng sau đó lại chết đi và tất cả môi trường MS còn lại đều cho tỉ lệ nảy mầm thấp hơn khi so sánh với môi trường ¼ có 10% CW.
4.3
Đánh giá thứ phát về các điều kiện ánh sáng và các thử nghiệm phù hợp cho nảy mầm, hình thành và phát triển protocorm (giai đoại 1 – 3)
Khi chúng tôi đánh giá sâu hơn về sự nảy mầm trên hai môi trường đã nêu ở trên, chúng tôi phát hiện rằng ở 40 ngày sau khi nảy mầm, tất cả 3 nhân tố – thời gian khử trùng, môi trường và ánh sáng – đều có ảnh hưởng đáng kể đến xác suất nảy mầm (bảng 1). Thời gian khử trùng là yếu tố ảnh hưởng đáng kể nhất đễn xác suất nảy mầm theo sau là môi trường và ánh sáng (P
Hình 2. Phần trăm hạt P. spicerianum hạt nảy mầm đánh giá sau 40, 70 và 90 ngày bắt đầu thí nghiệm. Chu kì quang: D = hạt nảy mầm trong chu kì 24 giờ tối và L = hạt nảy mầm trong 12 sáng và 12 giờ tối. ¼ MSCW = ¼ MS cải tiến bổ sung 10% nước dừa, và RECW = Môi trường Robert Ernst bổ sung 10% nước dừa. Hình a và b cho thấy tỉ lệ nảy mầm sau 40 ngày, hình c và d là tỉ lệ nảy mầm sau 70 ngày và hình e và f là tỉ lệ nảy mầm sau 90 ngày. Đường kẻ đen dày trong mỗi khung trên biểu đồ chỉ ra giá trị 50% của mỗi loài, đường kẻ thấp hơn và cao hơn đại diện cho 25 và 75%, thanh sai số là 10 và 90%. Đường kẻ trên hoặc dưới 10 và 90% đại diện cho điểm dữ liệu được lặp lại hơn 3 lần so với sai số chuẩn quan sát ( các đường viền bên ngoài)
Có những tương tác rõ rệt giữa các yếu tố ( thời gian khử trùng và môi trường, P < 0.0001; thời gian khử trùng và ánh sáng P < 0.0001; môi trường và ánh sáng P < 0.01; Bảng 1). Mặc dù tỉ lệ nảy mầm cao nhất được quan sát thấy trong môi trường RECW với thời gian khử trùng 40 bằng 1 % NaClO và giữ trong bóng tối (21.65 ± 1.88 % hạt nảy mầm; Hình 2b), tất cả protocorm có màu trắng sau đó chuyển sang nâu và chết đi (hình 2ba) và xem hình ảnh để so sánh trong Hình 3. Trong MSCW, cùng điều kiện cho tỉ lệ nảy mầm cao nhất (7.50 ± 0.75% hạt nảy mầm, hình 2a) cho tất cả môi trường này, nhưng hạt đã nảy mầm phát triển thêm thành protocorm màu xanh khỏe mạnh, hình 3, không giống như trên môi trường RECW, hình 2b. Ở 40 ngày, khi điều kiện có ánh sáng so sánh với điều kiện tối, xác suất nảy mầm cao hơn đáng kể trong điều kiện tối, đối với hạt được khử trùng khoảng 60 phút nuôi trong MSCW và khoảng 40 phút cho hạt nuôi trong RECW (bảng 2). Khi khử trùng khoảng 60 phút với 1% NaOCl, không hạt nào nảy mầm trên RECW trong điều kiện tối cũng như chu kì 12/12 giờ sáng/tối. Hạt được khử trùng khoảng 80 phút với 1% NaOCl không nảy mầm trên bất kì môi trường nào.
Khi nảy mầm được đánh giá ở 70 ngày, hạt được xử lý với NaOCl cho thấy không có sự khác biệt giữa các điều kiện sáng tối khác nhau, nhưng tỉ lệ nảy mầm rất thấp 0.97 ± 0.42% hạt nảy mầm cho cả hạt trong tối và sáng, hình 2c,d). Ngược lại hạt nảy mầm cao hơn trong bóng tối khi khử trùng 40 phút với 1% NaOCl (16.37 ± 4.94% trong MSCW và 50.25 ± 17.76% trong RECW). Khi hạt nảy mầm được đánh giá ở 90 ngày, kết quả tương tự như 70 ngày (Bảng 1 và 2, Hình 2e, f). Trong điều kiện tối với 40 phút khử trùng bằng NaOCl 1%, môi trường MSCW có 18.05 ± 5.44% hạt nảy mầm so sánh với 51.02 ± 18.04% trong RECW.
Hình 3. So sánh sự nảy mầm giữa hai môi trường. (a) Hình thành chồi xanh từ protocorm 70 ngày tuổi nảy mầm trong ¼ MS với 10% nước dừa. (b) Protocorm 70 ngày tuổi và đã chết trong môi trường Robert Ernst bổ sung 10% nước dừa.
Ngày sau khi gieo (ngày) 40 70 90 Môi trường MSCW Thời gian khử trùng (phút) 0 0.87 ± 0.67 ns 0. 0.39 ± 0.38 ns 0.37 ± 0.38 ns 40 -0.21 ± 0.20 ns -0.15 ± 0.14 ns -0.21 ± 0.14 ns 60 -1.78 ± 0.36*** -0.91 ± 0.21** -0.80 ± 0.20** 80 ng -1.32 ± 0.78 ns -1.32 ± 0.78 ns Môi trường RECW Thời gian khử trùng (phút) 0 -0.35 ± 0.15 ns -0.22 ± 0.12 ns -0.23 ± 0.12 ns 40 -1.19 ± 0.17*** -1.25 ± 0.12*** -1.27 ± 0.12*** 60 ng ng ng 80 ng ng ng
Thử nghiệm của FDA đã giúp hiểu rõ hơn về lý do tại sao hạt đã được xử lý 60 phút hoặc 80 phút với 1% NaOCl không nảy mầm trong khi hạt 40 phút lại nảy mầm thành công hơn. Hình ảnh chụp bằng UV so sánh với các hạt không xử lý hóa chất (hình 4a), hạt xử lý khoảng 40 phút với 1% NaOCl đã làm tan tế bào vỏ ở phần dài cuối hạt, nhưng tế bào vỏ bao quanh phôi vẫn còn nguyên vẹn và phôi vẫn còn sống (hình 4b). Hạt xử lý khoảng 60 phút với NaOCl, quan sát thấy vỏ đã nứt ra và gần 50% phôi không sống được. Trong thời gian xử lý khoảng 80 phút, phôi đã trồi ra ngoài vỏ, nhiều tế bào phôi bị chết và hầu như tất cả các phôi đều không sống được.
4.4
Đánh giá môi trường phù hợp để hình thành cây con (giai đoạn 4)
Trong 4 môi trường thử nghiệm, cây hình thành chỉ trên môi trường có 3.0 Hyponex No.1 với 1.0 mg/L NAA, 0.5 g/L than hoạt tính với 10% dịch chiết chuối (hình 1 e và f cho thấy cây phát triển sau 1 và 3 tháng). Tất cả các nghiệm thức có protocorm 90 ngày tuổi đều chuyển sang nâu và chết đi.
Hình 4. So sánh hạt trong các thời gian xử lý khác nhau với 1% NaOCl sau đó nhuộm với Fluorescent Diacetate, (a) Hạt không xử lý, (b) Hạt xử lý khoảng 40 phút, (c) Hạt xử lý khoảng 60 phút và (d) Hạt xử lý khoảng 80 phút
4.5
Đánh giá điều kiện phù hợp cho cây con tăng trưởng (giai đoạn 5)
Sự tăng trưởng của cây chịu ảnh hưởng đáng kể bởi thành phần môi trường, xác định thông qua tốc độ phát triên chiều dài lá (F5,36 = 3.652, P < 0.01). Tốc độ phát triên chiều dài lá cao nhất và lá vẫn có màu xanh ở môi trường có 3.0 g/L Hyponex, 1.0 mg/L NAA, 1.0 mg/L 6-BA, 0.5 g/L than hoạt tính và 10% dịch chiết chuối, so sánh với môi trường có 3.0 g/L Hyponex, 3.0 g/L peptone, 0.2 mg/L NAA, 2.0 mg/L 6-BA và 1 g/L than hoạt tính hoặc môi trường MS cải tiến với 0.2 mg/L NAA, 2.0 mg/L 6-BA và 2.0 g/L than hoạt tính. Tất cả môi trường còn lại đều khác nhau đáng kể và cho tốc độ phát triển chiều dài lá thấp hơn khi so sánh với môi trường 3.0 g/L Hyponex, 1.0 mg/L NAA, 1.0 mg/L 6-BA, 0.5 g/L than hoạt tính và 10% dịch chiết chuối (P < 0.05). Ba môi trường đầu tiên đều cho lá vàng nhưng cây con vẫn sống cho đến 6 tháng sau. Trong tất cả môi trường, chúng tôi thấy có trung bình 3 đến 4 chồi trên mỗi cụm chồi từ hạt nảy mầm.
Thử nghiệm FDA cho thấy hạt được xử lý 16 giờ trong ¼ MS có hạt khỏe (hình 6a), trong khi đó hạt trên môi trường MS có dấu hiệu co lại (Hình 6b). Hạt xử lý với RE, chúng tôi thấy, gần 50% tế bào phôi bị chết (hình 6c)
5.
Kết luận
Việc lựa chọn môi trường, điều kiện về thời gian sinh trưởng và xử lý hóa chất có ảnh đáng kể đến sự nảy mầm của hạt P. spicerianum. Theo như các báo cáo cho các loài Paphiopedilum khác (Pierik và cộng sự, 1988; Chen và cộng sự, 2004a,b; Ding và cộng sự, 2004; Long và cộng sự, 2010; Zeng và cộng sự, 2012), các thử nghiệm ban đầu về sự nảy mầm đã khẳng định rằng P. spicerianum nảy mầm tốt nhất trong điều kiện ít muối khoáng. Môi trường lý tưởng cho hạt của loài Paphiopedilum nảy mầm tùy thuộc vào đặc tính mỗi loài.
Hình 5. Sự tăng trưởng của cây được đánh giá bằng sự phát triển chiều dài và chiều rộng của lá dài nhất trong mỗi môi trường. Môi trường: 3.0 g/L Hyponex No 1, 0.5 mg/L NAA và 1.0 g/L than hoạt tính (HYPO1); 3.0 g/L Hyponex No 1, 2.0 mg/L 6-BA, 0.5 mg/L NAA và 1.0 g/L than hoạt tính (HYPO2); 3.0 g/L Hyponex No 1, 3.0 g/L peptone, 0.2 mg/L NAA, 2.0 mg/L 6-BA và 1 g/L than hoạt tính (HYPO3); 3.0 g/L Hyponex No 1, 1.0 mg/L NAA, 1.0 mg/L 6-BA, 0.5 g/L than hoạt tính và 10% dịch chiết chuối (HYPO4); MS cải tiến với 0.2 mg/L IBA, 0.2 mg/L 6-BA và 2.0 g/L than hoạt tính (MS-IBAO) và MS cải tiến với 0.2 mg/L NAA, 2.0 mg/L 6-BA và 2.0 g/L than hoạt tính (MS-NAAO). (a) Sự phát triển chiều dài lá tỉ lệ với những đo đạc ban đầu. (b) Sự phát triển chiều rộng lá tỉ lệ với những đo đạc ban đầu. Đường kẻ đen dày trong mỗi khung trên biểu đồ chỉ ra giá trị 50% của mỗi loài, đường kẻ thấp hơn và cao hơn đại diện cho 25 và 75%, thanh sai số là 10 và 90%. Đường kẻ trên hoặc dưới 10 và 90% đại diện cho điểm dữ liệu được lặp lại hơn 3 lần so với sai số chuẩn quan sát (các đường viền bên ngoài).
Thành phần của môi trường có thể thay đổi theo Môi trường Thomale GD cải tiến (Paphiopedilum hybrids; Flamee, 1978 cf. Zeng và cộng sự, 2012), Knudson C (KC; P. delenaii; Nhut và cộng sự, 2005), 1/4 MS (P. ciliolare; Pierik và cộng sự, 1988), 1/2 MS (P. wardii; Zeng và cộng sự, 2012). Hơn nữa, thậm chí cho cùng loài, P. micranthum, có vài báo cáo về môi trường khác tạo điều kiện tốt nhất cho nảy mầm ( Môi trường RE; Chen và cộng sự, 2004a,b; 1/5 MS; Ding và cộng sự, 2004).
Trong những thử nghiệm sâu hơn của chúng tôi về môi trường phù hợp cho nảy mầm, chúng tôi nhận thấy rằng thông qua prototocorm P. spicerianum được hình thành trong môi trường có nồng độ muối khoáng thấp ¼ MS, nhưng số lượng hạt nảy mầm trong môi trường ¼ MS ít hơn trong môi trường RE. Điều này tương tự như những gì Pierik và cộng sự (1988) tìm thấy khi so sánh KC và ¼ MS; KC cho số lượng hạt nảy mầm cao hơn nhưng hạt lại chết mà không phát triển nữa. KC có thành phần tương tự như RE và hạt giống vẫn giữ màu trắng khi phát triển trên môi trường RE, không phát triển chlorophyll và sau đó chuyển sang nâu và chết. Điểm khác biệt chính giữa MS với cả KC và RE là có nhiều vi lượng hơn cần thiết cho sự phát triển của cây.
Khi chúng tôi đánh giá cấu trúc hạt và sức sống của tế bào phôi bằng thử nghiệm FDA, chúng tôi thấy rằng hạt trong môi trường ¼ MS vẫn giữ được tính nguyên vẹn của chúng, trong khi đó môi trường MS làm cho hạt co lại (Hình 6). Kết quả này cho thấy môi trường MS có nồng độ chất tan quá cao cho P. spicerianum, dẫn đến chất tan đi vào trong hạt. Mặc dù chúng tôi không thấy sự co lại đối với hạt trong xử lý trong RE, nhưng chúng tôi quan sát thấy sự chết tế bào cục bộ trong phôi trong những hạt này, có thể nhìn thấy như không gian màu đen trong phôi, cho thấy các thành phần của môi trường RE có thể độc hại đối với một số tế bào phôi. Có một số điều chưa rõ ràng trong nghiên cứu này, rằng tại sao hay nhân tố nào trong môi trường RE đã gây ra sự chết tế bào và điều này nên được nghiên cứu sâu hơn. Tuy nhiên, bởi vì hạt trong môi trường RE đã bị phồng lên và chuyển sang màu trắng, nhưng chúng lại không phát triển thành tế bào xanh, nên chúng tôi cho rằng chất độc có thể ảnh hưởng đến sự hình thành chlorophyll sau khi tế bào nở ra.
Theo những gì chúng tôi biết về các loài Paphiopedilum khác, hàm lượng muối khoáng thấp không chỉ là yếu tố duy nhất có ảnh hưởng đến sự nảy mầm và sự phát triển của protocorm. Chu kì quang và thời gian xử lý hóa chất khử trùng có ảnh hưởng đáng kể đến xác xuất nảy mầm. Chúng tôi thấy rằng, ngoại trừ hạt không được xử lý hóa chất và hạt được xử lý khoảng 40 phút và nảy mầm trên môi trường MSCW, trong các nghiệm thức có hạt nảy mầm khác nếu có chu kì quang 24 giờ tối sẽ làm tăng xác suất nảy mầm so với chu kì quang sáng tối 12/12 giờ. Pierik và cộng sự (1988) báo cáo rằng có mỗi tương quan âm giữa sự nảy mầm và sự gia tăng cường độ chiếu sáng đối với hạt P. ciliolare. Chúng tôi thấy rằng nghiệm thức có 24 giờ tối trong 30 ngày cho kết quả hạt nảy mầm cao nhất đối với P. ciliolare. Zeng và cộng sự (2012) báo cáo rằng thời gian của thử nghiệm tối có ảnh hưởng đáng kể đến tỉ lệ nảy mầm; hạt xử lý tối trong 45 ngày có tỉ lệ nảy mầm cao nhất. Những nghiên cứu báo cáo rằng môi trường nuôi cấy có thể điều chỉnh ảnh hưởng của ánh sáng lên sự nảy mầm. Stimart và Ascher (1981) báo cáo rằng môi trường Thomale GD cải tiến trong tối thúc đẩy mạnh mẽ hạt nảy mầm cũng như sự sống sót protocorm giống lai Paphiopedilum, trong khi đó sự nảy mầm tốt nhất là trong môi trường Burgett EG-1 khi có ảnh sáng mặc dù về sau hạt bị chết đi. Nghiên cứu của Zeng và cộng sự (2012) báo cáo rằng xử lý tối liên tục lên hạt sẽ không hình thành cây con, cho thấy rằng ánh sáng là một ý nghĩa sinh thái quan trọng trong việc phát triển cây con, mặc dù không rõ lý do tại sao việc xử lý tối thúc đẩy nảy mầm hạt địa lan. Người ta thừa nhận rằng các loài phong lan cần ánh sáng để nảy mầm trong khi đó các loài địa lan lại cần điều kiện tối. Tuy nhiên, đây là hiện tượng phức tạp và kết quả của chúng tôi và những người khác cho thấy rằng nhu cầu ánh sáng cho sự nảy mầm của chi Paphiopedilum đặc trưng cho từng loài và từng giai đoạn nảy mầm.
Cho nảy mầm in vitro ở hạt lan chín có thể thất bại bởi vì cơ chế cơ học hoặc sinh lý làm cho hạt duy trì trạng thái ngủ. Trạng thái ngủ của hạt có thể bị phá vỡ bởi các chế độ nhiệt độ nhất định, sự hấp thụ kéo dài, làm mềm hóa vỏ với Ca(OCl)2 hoặc NaOCl, hoặc do phá hỏng cơ học (Zeng và cộng sự, 2013). Những nghiên cứu về nảy mầm hạt lan đã cho thấy hạt còn non nảy mầm tốt hơn hạt trưởng thành bởi vì lớp vỏ càng trưởng thành càng khó thấm nước (Ramsay và Stewart, 1998; Kauth và cộng sự, 2008). Tuy nhiên điều này còn tùy theo loài, đối với Cypripedium debile, một loài cùng phân họ với Paphiopedilum, hạt trưởng thành nảy mầm tốt hơn so với hạt còn non bởi vì lớp tế bào biểu bì ở vỏ sắp xếp thưa thớt làm cho vỏ ít kị nước hơn (Hsu và Lee, 2012). Đối với chi Paphiopedilum, ảnh hưởng của sự trưởng thành của vỏ hạt, được đo bằng số lượng ngày sau khi thụ phấn (DAP), được biết là rất khác nhau. Ở P. godefroyae, thời gian tối ưu là 90 đến 120 ngày (Lee, 2007), trong khi đó P. villosum var. Densissimum DAP từ 170 đến 190 ngày (Long và cộng sự, 2010). Trong nghiên cứu này của chúng tôi, chúng tôi không thể kiểm tra thành công ảnh hưởng của độ trưởng thành của hạt lên sự nảy mầm bởi vì chúng tôi chỉ có hai quả có hạt từ quần thể rất nhỏ P. spicerianum, và tất cả các thí nghiệm đều được tiến hành ở hạt 365 DAP. Nghiên cứu trước đây của Lee (2007), hạt của P. spicerianum lấy từ nhà kính cho 40-50% nảy mầm khi sử dụng hạt 120-180 DAP. Nảy mầm tốt nhất trong nghiên cứu này là ở 90 ngày với tỉ lệ trung bình là 18.05 ± 5.44%. Vì vậy, hạt càng non thì tỉ lệ nảy mầm càng cao.
Hình 6. Cấu trúc hạt và đánh giá tế bào sau khi ngâm trong các môi trường khác nhau và nhuộm bằng fluorescent diacetate . a. Hạt ngâm trong dung dịch 1/4 MS , b. Hạt ngâm với dung dịch MS, c và d. Hạt ngâm trong dung dịch RE. Tất cả các hạt đã được xử lý với 1% NaOCl trong 40 phút trước khi ngâm trong mỗi dung dịch môi trường.
Tăng cường môi trường với các chất điều chỉnh tăng trưởng thực vật, carbohydrate cung cấp nguồn năng lượng, các chất bổ sung hữu cơ kích thích sự phát triển và các vitamin có lợi, tất cả được cho là thuận lợi trong quá trình hình thành và tăng trưởng tế bào dị dưỡng của cây lan (Arditti, 1967, 1982; Kauth và cộng sự , 2008). Tương tự như những gì chúng tôi tìm thấy trong P. spicerianum, Zeng và cộng sự (2012) cũng tìm thấy trong P. wardii rằng môi trường Hyponex bổ sung với dịch chiết chuối là thích hợp nhất cho việc hình thành cây con. Dịch chiết chuối có thể thúc đẩy sự hình thành cây con vì bổ sung các chất dinh dưỡng và đủ lượng đường cung cấp cho môi trường. Trong khi Zeng và cộng sự (2012) đã sử dụng peptone như một chất điều chỉnh tăng trưởng thực vật, thì trong nghiên cứu của chúng tôi cùng một môi trường với peptone thêm vào, lại không hình thành cây con. Tương tự P. wardii, P. spicerianum phản ứng tốt với việc bổ sung NAA để thúc đẩy sự phát triển của rễ, và than hoạt tính rất quan trọng để hấp thụ các hóa chất độc hại được tạo ra trong quá trình tạo cây con. Ngược lại, Long và cộng sự (2010) nhận thấy trong bốn loài Paphiopedilum sự bổ sung của NAA và BA đã tạo thành lá xanh, nhưng các lần cấy chuyền cây con về sau đã không thành công. Long và cộng sự cũng chỉ ra rằng không có sự thống nhất trong việc nhân giống chồi khi nồng độ NAA và BA khác nhau (Long và cộng sự, 2010). Trong nghiên cứu của chúng tôi, môi trường MS cơ bản giống nhau thì tốt cho sự nảy mầm hạt nhưng lại không thành công trong sự hình thành cây con. Tóm lại, kết quả của chúng tôi và các nghiên cứu trước đây về các loài Paphiopedilum chỉ ra rằng môi trường tốt nhất cho việc hình thành cây con phải được xác định riêng cho từng loài nghiên cứu.
Khi chúng tôi đánh giá sự tăng trưởng của cây con, chúng tôi thấy rằng cùng một môi trường hỗ trợ sự hình thành cây con, chứa 3.0 g/L Hyponex No 1, 1.0 mg/L NAA, 0.5 g/L than hoạt tính và 10% dịch chiết chuối là tốt nhất cây con tăng trưởng, nhưng với điều kiện bổ sung thêm 1.0 mg/L 6-BA. BA được biết đến để thúc đẩy sự hình thành lá cây ở các loài Paphiopedilum khác nhưng ở các nồng độ khác nhau (Huang và cộng sự, 2001). Trong nghiên cứu của chúng tôi, ba môi trường đã được thử nghiệm về tốc độ tăng trưởng của thân cây non đã bị thất bại. Trong ba môi trường còn lại, lá có màu vàng nhưng cây con vẫn còn sống ngay cả khi kết thúc 4 tháng. Trong nghiên cứu của chúng tôi, chúng tôi thu được trung bình ba đến bốn chồi trên mỗi hạt nảy mầm. Tuy nhiên, trong hầu hết các trường hợp Paphiopedilum sản xuất ít chồi trên mỗi đốt (Chen và cộng sự, 2004a, b, Hong và các cộng sự, 2008).
Giới hạn chính của nghiên cứu này là sự sẵn có của hạt giống đối với thí nghiệm. Đây là một khó khăn không thể tránh khỏi khi làm việc với PSESPs. Trong cách tiếp cận của chúng tôi để phát triển sự nảy mầm hạt giống, sự hình thành và phát triển cây con, chúng tôi đã sử dụng nhiều môi trường có chứa các thành phần và nồng độ khác nhau dựa trên kinh nghiệm của chúng tôi về các loài cùng chi này, liên lạc với các chuyên gia trong lĩnh vực này và dựa vào các tài liệu đã xuất bản. Sẽ là một ý tưởng hay nếu phát triển các quy trình của chúng tôi ở cách tiếp cần từng bước và hợp lý hơn. Những hạn chế khác bao gồm việc không biết cây con được sinh ra sống sót như thế nào trong tự nhiên; các thí nghiệm tiếp theo sẽ kiểm tra điều này (xem hình 1. g, cây con được trồng vào trong đất , sẵn sàng để đưa về tự nhiên). Zeng và cộng sự (2012) đã có thể đưa về tự nhiên thành công một loài Paphiopedilum khác, chứng tỏ rằng phương pháp này có thể thành công trong việc phát triển cây con để trả về tự nhiên. Chúng tôi cũng đã không kiểm tra ảnh hưởng của sự trưởng thành của vỏ quả đối với sự nảy mầm của hạt (Lee, 2007). Cuối cùng, các thí nghiệm của chúng tôi được tiến hành trên các hạt giống thu được từ một quần thể đơn và so sánh các quy trình không cộng sinh với các quần thể khác ở miền bắc Ấn Độ và Myanmar (Liu và cộng sự, 2009) được khuyến khích, vì các quần thể khác nhau có thể có sự khác biệt về nhu cầu nảy mầm và tăng trưởng do sự thích ứng địa phương. Mặc dù có những hạn chế này nhưng chúng tôi đã đưa ra được lộ trình đầu tiên về sự nảy mầm của một trong những loài địa lan dễ bị tổn thương nhất thế giới mà có tiềm năng về trồng trọt cao. Các loài có quy mô quần thể nhỏ có xu hướng biến động theo nhóm ngẫu nhiên dẫn đến sự tuyệt chủng (Purvis và cộng sự, 2000, Melbourne và Hastings, 2008). Vì vậy, đây là thời điển quan trọng và nhạy cảm để phát triển phương pháp bảo tồn tổng hợp cho loài P. spicerianum. Cho nảy mầm in vitro là một phương pháp thuận lợi cho việc sản xuất cây trồng quy mô lớn, có thể được sử dụng để trả về tự nhiên, cũng như nhân giống thương mại, do đó làm giảm áp lực thu hái quần thể hoang dã.
6.
Kết luận
Dựa vào nghiên cứu của chúng tôi, chúng tôi đưa ra những khuyến cáo sau đây để tăng cường sự nảy mầm của hạt và có được sự phát triển protocorm đối với các loài này: tiền xử lý quả giống được thực hiện với NaOCl 1% trong khoảng 40 phút và hạt giống cần được nảy mầm trong chu kì quang là 24 giờ tối trong khoảng 30 ngày trong 1/4 MS cải tiến bằng cách làm giảm agar đến 6 g/L và sucrose đến 20 g/L và bổ sung 10% nước dừa. Đối với sự hình thành cây con, chúng tôi khuyến cáo nên sử dụng protocorm 90 ngày tuổi trong 3.0 g/L Hyponex No 1 với 1.0 mg/L NAA, 0.5g/L than hoạt tính và 10% dịch chiết cuối chuối, nuôi trong 6 tháng trước khi chuyển sang môi trường để tăng trưởng cho cây. Đối với quá trình tăng trưởng cây, chúng tôi khuyến cáo sử dụng các môi trường tương tự với tạo cây giống, có bổ sung 1.0 mg/L 6-BA. Chúng tôi kết luận rằng thử nghiệm của FDA có hiệu quả có thể được sử dụng để sàng lọc một số lượng nhỏ các hạt giống để khử trùng và tìm ra môi trường thích hợp cho cho phát triển. Việc sàng lọc như vậy là rất quan trọng đối với sự nảy mầm của các loài quý hiếm và có nguy cơ tuyệt chủng bởi vì chúng có số lượng hạt giống hạn chế để thử nghiệm và phát triển các quy trình.
Lời cảm ơn
Nghiên cứu này được Quỹ khoa học tự nhiên quốc gia Trung Quốc hỗ trợ (số 31170358) cho J.Y. Gao và bản thảo đã được Quỹ khoa học sau Tiến sĩ Trung Quốc năm 2013 (2013M531997 và 2014T70894) hỗ trợ tài chính cho U.M. Goodale. Chúng tôi rất biết ơn Phòng thí nghiệm Trung ương XTBG về sự trợ giúp kỹ thuật bằng kính hiển vi điện tử quét và gửi lời cảm ơn đến Q. Liu vì đã thu thập hạt giống. Chúng tôi cảm ơn Tiến sĩ Richard Corlett và Tiến sĩ Eben Goodale đã biên tập và cung cấp các ý kiến có giá trị về bản thảo này.
Tài liệu tham khảo
Arditti, J., 1967. Factors affecting the germination of orchid seeds. Bot. Rev. 33, 1–97.
Arditti, J., 1982. Orchid Biology: Reviews and Perspective II. Cornell University, Ithaca, NY.
Bretz, F., Hothorn, T., Westfall, P., 2010. Multiple Comparisons Using R. Chapman and Hall, CRC, Boca Raton.
Chen, T.Y., Chen, J.T., Chang, W.C., 2002. Multiple shoot formation and plant regeneration from stem nodal explants of Paphiopedilum orchids. In Vitro Cell Dev.-Plant 38, 595–597.
Chen, T.Y., Chen, J.T., Chang, W.C., 2004a. Plant regeneration through direct shoot bud formation from leaf culture of Paphiopedilum orchids. Plant Cell Tissue Organ. Cult. 76, 11–15.
Chen, Z.L., Ye, X.L., Liang, C.Y., Duan, J., 2004b. Seed germination in vitro of Paphiopedilum armeniacum and P. micranthum. Acta Hortic. 31, 540–542. Clarke, J., Gillings, M., Altavilla, N., Beattie, A., 2001. Potential problems with fluorescein diacetate assays of cell viability when testing natural products for
antimicrobial activity. J. Microbiol. Meth. 46, 261–267.
CITES, 2013. Convention on International Trade in Endangered Species of Wild Fauna and Flora, Appendices I. Geneva, Switzerland.
Copeland, L., McDonald, M., 2001. Principles of Seed Science and Technology, fourth ed. Kulwer Academic Publishers Group, MA, USA.
Ding, C.C., Wu, H., Liu, F.Y., 2004. Factors affecting the germination of Paphiopedilum armeniacum. Acta Bot. Yunnanica 26, 673–677.
Fay, M.F., 1992. Conservation of rare and endangered plants using in vitro methods. In Vitro Cell Dev.-Plant 28, 1–4.
Flamee, M., 1978. Influence of selected media and supplements on the germination and growth. Am. Orchid Soc. Bull. 47, 419–423.
Hong, P.I., Chen, J.T., Chang, W.C., 2008. Plant regeneration via protocorm like body formation and shoot multiplication from seed derived callus of a maudiae type slipper orchid. Acta Physiol. Plant. 30, 755–759.
Hsu, R.C.C., Lee, Y.I., 2012. Seed development of Cypripedium debile Rchb. f. in relation to asymbiotic germination. Hortic. Sci. 47, 1495–1498.
Huang, L.C., Lin, C.J., Kuo, C.I., Huang, B.L., Murashige, T., 2001. Paphiopedilum cloning in vitro. Sci. Hortic. 91, 111–121.
Kauth, P., Dutra, D., Johnson, T., 2008. Techniques and applications of in vitro orchid seed germination. In: Teixeira da Silva, J.A. (Ed.), Floriculture,
Ornamental and Plant Biotechnology: Advances and Topical Issues. Global Science Books, Iselworth, UK, pp. 375–391.
Knudson, L., 1922. Non-symbiotic germination of orchid seeds. Bot. Gaz. 73, 1–25.
Lee, Y.I., 2007. The asymbiotic Seed germination of six Paphiopedilum species in relation to the time of seed collection and seed pretreatment. Int. Soc.
Hortic. Sci. 381–386.
Liao, Y.Z., Chen, J.J., 2006. Asymbiotic seed germination of Paphiopedilum. In: Paphiopedilumin Taiwan IV, vol. 23. Taiwan Paphiopedilum Society, pp. 11–14.
Liu, Z.J., Chen, S.C., Chen, L.J., Lei, S.P., 2009. The Genus Paphiopedilum in China. Science Press, Beijing.
Long, B., Niemiera, A.X., Cheng, Z.Y., Long, C.L., 2010. In vitro propagation of four threatened Paphiopedilum species (Orchidaceae). Plant Cell Tissue Organ.Cult. 101, 151–162.
Ma, Y., Chen, G., Grumbine, R.E., Dao, Z., Sun, W., Guo, H., 2013. Conserving plant species with extremely small populations (PSESP) in China. Biodivers.
Conserv. 22, 803–890.
Melbourne, B., Hastings, A., 2008. Extinction risk depends strongly on factors contributing to stochasticity. Nature 454, 100–1003.
Mohanty, P., Paul, S., Das, M.C., Kumaria, S., Tandon, P., 2012. A simple and efficient protocol for the mass propagation of Cymbidium mastersii: an ornamental orchid of Northeast India. AoB Plant. 2012, 1–8. http://dx.doi.org/10.1093/aobpla/pls023.
Murashige, T., Skoog, F., 1962. A revised medium for rapid growth and bio-assays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant. 15, 473–497.
Nhut, D., Trang, P., Vu, N., Thuy, D., Khiem, D., Binh, N., Van, K., 2005. A wounding method and liquid culture in Paphiopedlium delenatii propagation. Propag.Ornam. Plants 5, 156–161.
Pierik, R., Sprenkels, P., Van der Harst, B., Van der Meys, Q., 1988. Seed germination and further development of plantlets of Paphiopedilum ciliolare Pfitz.
In vitro. Sci. Hortic. 34, 139–153.
Purvis, A., Gittleman, J., Cowlishaw, G., Mace, G., 2000. Predicting extinction risk in declining species. Proc. R. Soc. Lond. Ser. B Biol. 267, 1947–1952.
R Development Core Team, 2011. R: A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing, Ed version 3.1.1, Vol. 2013. R Development Core Team, Vienna, Austria.
Ramsay, M., Stewart, J., 1998. Re-establishment of the lady’s slipper orchid (Cypripedium calceolus L.) in Britain. Bot. J. Linn. Soc. 126, 173–181.
Ren, H., Zhang, Q., Lu, H., Liu, H., Guo, Q., Wang, J., Jian, S., Bao, H., 2012. Wild plant species with extremely small populations require conservation and reintroduction in China. Ambio 41, 913–917.
Sarasan, V., Cripps, R., Ramsay, M.M., Atherton, C., McMichen, M., Prendergast, G., Rowntree, J.K., 2006. Conservation in vitro of threatened plants—progress in the past decade. In Vitro Cell Dev.-Plant 42, 206–214.
Sgarbi, E., Grimaudo, M., Del Prete, C., 2009. In vitro asymbiotic germination and seedling development of Limodorum abortivum (Orchidaceae). Plant Biosyst. 143, 114–119.
Sileshi, G., 2012. A critique of current trends in the statistical analysis of seed germination and viability data. Seed Sci. Res. 22, 145–159.
State Forestry Administration of China, , 2012. The Saving and Conservation Program on Extremely Small Populations in China. State Forestry Administration of China, Beijing.
Stewart, S.L., 2008. Orchid reintroduction in the United States: a mini review. N. Am. Nativ. Orch. J. 14, 54–59.
Stimart, D., Ascher, P., 1981. In vitro germination of Paphiopedilum seed on a completely defined medium. Sci. Hortic. 14, 165–170.
Swarts, N.D., Dixon, K.W., 2009. Terrestrial orchid conservation in the age of extinction. Ann. Bot. 104, 543–556.
Ye, D., Luo, Y., 2006. Paphiopedilum spicerianum, a new record of Orchidaceae from China. Acta Phytotaxon. Sin. 44, 471–473.
Zeng, S., Wu, K.L., Teixeira da Silva, J., Zhang, J.X., Chen, Z.L., Xia, N.H., Duan, J., 2012. Asymbiotic seed germination, seedling development and reintroduction of Paphiopedilum wardii Sumerh., an endangered terrestrial orchid. Sci. Hortic. 138, 198–209.
Zeng, S.J., Zhang, Y., Teixeira da Silva, J.A., Wu, K.L., Zhang, J., Duan, J., 2013. Seed biology and in vitro seed germination of Cypripedium. Crit. Rev. Biotechnol.
Khải Mùi SBC Scientific
Kỹ Thuật Nuôi Trồng Lan Nuôi Cấy Mô
Có rất nhiều cách trồng và chăm sóc lan khác nhau, có người thích chăm từng kie nhỏ nhỏ, nhưng có người thích trồng và chăm sóc đại trà, có người thích trồng lan cấy mô. Riêng hôm nay mình sẽ chia sẻ kinh nghiệm riêng của mình về cách nuôi trồng phong lan từ chai mô, và liệu rằng cây lan cấy mô nuôi có dễ không, quy trình nuôi trồng như thế nào, tỷ lệ sống sau khi ra chai có cao không, mặt hoa có đảm bảo không?
Kỹ thuật nuôi trồng lan nuôi cấy mô
Tỷ lệ lan cấy mô sống sót sau khi ra chai có thể đạt tới trên 90% nếu chăm sóc đúng theo quy trình và những bước quan trọng trong quá trình nuôi trồng lan cấy mô trong chai và những bước sau khi ra chai sẽ được thể hiện qua bài viết sau: Kỹ thuật trồng lan nuôi cấy mô
Bước 1: chọn chai mô giống Để có được những cây sau khi ra chai khỏe mạnh ta nên lựa chọn những cây lan có bộ rể dài và mập mạp, khi cây con khỏe mạnh sẽ có bộ rễ phát triển hoàn chỉnh
Lá cây lan cấy mô có màu xanh đặc trưng của giống mà chúng ta lựa chọn
Chiều cao cây từ 3-5cm, nếu nhỏ quá cây sẽ khó phát triển
Cây con không bị bệnh ( không có nấm trắng, bên trong còn thạch) là tiêu chuẩn đầu tiên lựa chọn để ra chai
Bước 2: Làm quen với mô trường sống bên ngoài vườn trồng Khi đã lựa chọn được những chai giống tốt ta mang chai về và chưa cần phải cho ra chai ngay, nên để yên cây lan trong chai từ 5-10 ngày, nơi có ánh sáng vừa phải, tránh ánh nắng trực tiếp từ mặt trời.
Hàng ngày kiểm tra độ ẩm trong chai, xem tình hình sâu bệnh của cây giống
Bước 3: Tách cây lan giống ra khỏi chai Ở bước này rất quan trọng, bạn sẽ tiến hành lấy cây lan con ra, lúc này bạn có thể tiến hành như sau:
cho nước mát vào trong chai rồi lắc nhẹ để tách lớp thạch và cây ra và sau đó dốc ngược và trong thau nước sạch và cho cây tuột ra khỏi chai
hoặc có thể tiến hành phá vỡ lớp vỏ chai và lấy trực tiếp cây từ bên trong chai ra, nếu cây lớn trên 5cm thì ta chỉ có thể tiến hành đập chai đi và lấy cây con, tránh làm tổn thương tới ộ rễ
Ta rửa sạch cả cây và bộ rễ qua nhiều lần nước sạch và hạn chế tối đa làm tổn thương tới bộ rễ, thân , lá.
Ta nên tiến hành rửa một cách nhanh chóng, trong khoảng 5 phút và hạn chế để cây lâu ở môi trường nước, sẽ làm cho cây dễ bị úng, thối dẩn tới cây bị chết.
Bước 4: Xử lý cây giống sau khi ra chai ở bước này ta nên xử lý cây trước khi mang cây đi trồng để giúp cây khỏe mạnh và loại bỏ nguần bệnh hại cây.
Thuốc trị nấm (Citizen 75WP ,Thuốc trị nấm bệnh Bordeaux M 25 WP …) Liều lượng: 0.5 gam/ 5 lít nước sạch
Ngâm nước có pha kích thích rễ (Phân bón lá Root 2, Thuốc kích rễ N3M …) Liều lượng:
Root 2: 0.8 ml / 5 lít nước sạch
N3M: 1 gam/ 10 lít nước sạch
Thời gian xử lý: Ngâm từ 5 – 7 phút
Sau đó cây ra nhẹ nhàng để ráo nước trên rổ (giữ ẩm cho rễ và lá cây giống không bị héo).
Bước 5: Chuẩn bị giá thể trồng lan cấy mô ở bước này ta cần lựa chọn những giá thể như sau:
Ta nên dùng dớn để trồng lan cấy mô
Dớn chile là tốt nhất để trồng những cây lan cấy mô con.
Chuẩn bị them chậu mô
Khau mô là những dụng cụ cần thiết nhất.
Xử lý giá thể trước khi trồng lan cấy mô
Đối với dớn chile sau khi mua về ta tiến hành ngâm giá thể vào trong nước rồi xả thành nhiều lần, đồng thời kết hợp ngâm với nước vôi trong 1 ngày để nước vôi diệt các loại côn trùng hại cây lank hi còn non và rửa lại với nước sạch
Bước 6: Trồng cây lan cấy mô vào chậu nhỏ Đối với bước này khá đơn giản nhưng cũng là bước cần phải chú ý nhất vì tránh làm tổn thương bộ rễ của cây.
Ta quấn quanh bổ ễ bằng một lớp dớn trắng, để phần cổ rễ nằm hoàn toàn trong bề mặt dớn,không nên nhét quá nhiều vào sẽ khiến cho cây không thông thoáng và dẩn tới cây không phát triển,
Sau đó cho các chậu cây vào Khay đựng chậu lan mô.
– Đem ra vườn ươm, (Có che nắng, mưa). Dùng bình xịt tưới nước 2-4 lần/ngày tuỳ theo mùa nắng hay mùa mưa. Chú ý chỉ tưới nước ướt lá, phun sương giữ ẩm cho cây ra rễ mới trong tuần đầu.
Bước 7: Chăm sóc sau khi trồng lan cấy mô Liều lượng chung bón phân thuốc cho cây lan mô: Chỉ pha liều lượng 30% so với liều lượng của nhà sản xuất.
Tất cả các loại phân thuốc có thể pha chung khi phun cho cây khi tưới.
Tuần 1: Phun kích rễ N3M. Lịch Phun: Cách 2 ngày tưới 1 lần, phun vào buổi sáng. Phun hết 1 tuần.
Cách Phun: Phun mù nước cho lá ướt.
Tuần 2: Phun phân bón lá Grow more 30-10-10 + Thuốc kích thích rễ N3M. Lịch phun: Cách 2 ngày tưới 1 lần, phun vào buổi sáng. Phun hết 1 tuần.
Cách Phun: Phun mù nước cho lá ướt.
Tuần 3: Phun phân bón lá Grow more 30-10-10 + Thuốc kích thích rễ N3M + Atonik. Lịch phun: Cách 2 ngày tưới 1 lần, phun vào buổi sáng. Phun hết 1 tuần.
Cách Phun: Phun mù nước cho lá ướt.
Tuần 4: Phun phân bón lá Grow more 30-10-10 + Thuốc kích thích rễ N3M + Phân bón lá Vitamin B1 Lịch phun: Cách 2 ngày tưới 1 lần, phun vào buổi sáng. Phun hết 1 tuần.
Cách Phun: Phun mù nước cho lá ướt.
Phân bón cho cây lan cấy mô Lan giống cần nhiều đạm để sinh trưởng, nảy chồi ra lá, bón “Npk 30.10.10 + B1” định kỳ 5-7 ngày/ lần; có thể phun thay phiên với “Phân Bón Chuyên Lan” – sản phẩm của Lan Việt, có chứa Npk, Humic USA, môi trường dinh dưỡng cấy mô và một vài nguyên tố trung vi lượng.
(Lưu ý: liều lượng pha giảm còn 30% so với hướng dẫn, sau 2-4 tuần tăng dần lên 50% ; 70% ; 100%).
– Bên cạnh phân vô cơ, cũng cần dùng thêm phân hữu cơ giúp lan giống phát triển toàn diện, hấp thụ phân vô cơ tốt hơn; hiện tại dưới vườn Lan Việt đang phun luân phiên với ” Rong biển Seaweed” (dạng gói nhỏ và dạng chai 500ml) và “Humic USA” (dạng bột, tan 100%, 95% humic nguyên chất) thấy cây mau nảy mầm, xanh lá và bộ rễ ra nhanh, khỏe hơn; định kỳ 7-10/ lần.
– Cuối cùng, đừng bổ sung trung vi lượn giúp cây tránh thiếu chất, không chỉ cây giống mà cả cây trưởng thành cũng cần “Cam Bi Nhật” 3-4 tuần/ lần; các bác muốn lá to có thể bổ sung “Terra – Sorb Foliar”.
– Ngoài ra có thể cho cây giống ăn thêm phân tan chậm (phân chì Nhật 14.13.13 ; 13.11.11+TE hoặc phân dê).
+ Thuốc phòng trừ bệnh cho lan cấy mô
– Phun luân phiên các loại thuốc trừ nấm sau Ridomil ; Coc85 hoặc Citizen (tránh kháng thuốc) giúp cây giống phòng một số bệnh do nấm; mùa khô định kỳ 3-4 tuần/ lần; mùa mưa định kỳ 1-2 tuần/ lần
Điều kiện vườn lý tưởng + Ngoài yếu tố chăm sóc thì điều kiện vườn cũng rất quan trọng để lan giống phát triển nhanh, khỏe.
+ Tưới nước: mùa khô ngày tưới 2 lần, tưới đẫm vào buổi sáng, chiều khô rồi tưới lại; mùa mưa 1-2 ngày tưới 1 lần.
+ Độ nắng sáng cho vườn giống lan cấy mô là 60-70%; thoáng gió, độ ẩm vừa phải.
+ Có tôn sáng che mưa, các bác có thể ra ngoài mua loại tôn sáng mỏng hoặc nilon che mưa, che thêm một lớp lưới thưa che nắng.
Trên thị trường hiện nay, có rất nhiều địa chỉ cung cấp các loại giống lan nuôi cấy mô. Nhưng ở đâu mới thật sự chất lượng, uy tín và đáng tin cậy ??
Hôm nay, xin giới thiệu đến bạn đọc Trung tâm bảo tồn giống hoa lan – một địa chỉ chuyên cung cấp giống lan nuôi cấy mô chất lượng và uy tín.
Trung tâm Bảo tồn giống hoa lan – Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam là đơn vị trực thuộc Trung tâm Nông nghiệp Công nghệ cao là đối tác của Công ty TNHH Đầu tư và phát triển Nông Nghiệp Bền Vững được thành lập từ năm 2012 dưới sự quản lý của Tiến sĩ Hoàng Thị Giang – Chuyên gia về Công nghệ sinh học, công nghệ nuôi cấy mô tại trường Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam.
Nhận thức được sự cần thiết của việc nhân giống hoa lan và bảo tồn chúng, Trung tâm đã nuôi cấy thành công các Giống Hoa Lan quý, hiếm có nguy cơ cao và lai tạo thành công nhiều giống lan mới góp phần vào việc Bảo tồn, duy trì và đa dạng các Giống Hoa Lan ở Việt Nam. Các giống lan được Trung tâm bảo tồn và lai tạo thành công phải kể đến như: Phi điệp lá mít, phi điệp tím Hòa Bình, phi điệp Lạng Sơn, Ám Hòa Bình, Thác bay, … và nhiều giống khác đang được lai tạo. Sự ủng hộ và tin tưởng của khách hàng sẽ trở thành nguồn cảm hứng lớn lao cho Trung tâm nghiên cứu và phát triển thêm trong lĩnh vực Hoa Lan.
Trên thị trường, giá một chậu lan cấy mô dao động từ 15.000VNĐ – 500.000VNĐ, tuy nhiên ở Trung tâm bảo tồn giống hoa lan giá một cây lan nuôi cấy mô có giá trung bình 30.000VNĐ – so với thị trường đây là mức giá rất phải chăng phù hợp với mọi nhà vườn cũng như người chơi lan.
Nuôi Cấy Mô Lan Kim Tuyến
Trong bài viết này sẽ giới thiệu kỹ thuật nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy mô thực vật trên cây Lan Kim Tuyến hay còn được gọi với tên gọi khác là Lan Kim Tuyến lông cứng, Kim Tuyến, Kim Tuyến Tơ, Lan Gấm, Cỏ Nhung, Kim Cương hay Giải Thuỷ Tơ. Lan Kim Tuyến có danh pháp khoa học là Anoectochilus setaceus. Các môi trường sử dụng: MS vitamins, Knudson C Orchid, và môi trường SH( SCHENK & HILDEBRANDT BASAL SALT MEDIUM).
Nuôi cấy mô Lan Kim Tuyến- Lan Gấm- Cỏ Nhung hay Kim Cương
Lan Kim Tuyến được xem là một vị thuốc có tác dụng trị lao phổi, ho phế nhiệt, viêm khí quản, phong thấp, đau nhức khớp xương, đau do chấn thương, viêm dạ dày mãn tính, gan mãn tính, suy nhược thần kinh; ngoài ra còn giúp tăng cường thể lực, lưu thông khí quyết và có tính kháng khuẩn. Bởi trong thành phần của Lan Kim Tuyến có các hoạt chất như: quercetin, isoharmnetin-3-O-beta-D-glucopyranosid, kaempferol-3-O-beta-D-glucopyranosid, 5-hydroxy-3′-4′-7′-trimethoxyflavonol-3-O-beta-D-rutinosid và isorhamnetin-3-O-beta-D-rutinosid.
Do nhu cầu bùng nổ các loại thuốc có nguồn gốc thực vật nên dẫn đến việc khai thác quá mức, làm đe doạ đến sự tồn vong của các loài cây quý trong đó có Lan Kim Tuyến. Cho đến nay, đã có một số công trình nghiên cứu về nhân giống in vitro trong và ngoài nước trên đối tượng lan này như Shiau et al., (2002); Ket et al., (2003, 2004); Nhut et al., (2006); Phùng Văn Phê và cộng sự (2010); Nguyễn Quang Thạch và Phí Thị Cẩm Miện, 2012; Nguyễn Tuấn Anh và cộng sự (2013).
Quá trình nhân giống Lan Kim Tuyến bằng phương pháp nuôi cấy mô thực vật được chia làm 3 bước:
A. Giai khử trùng và vô mẫu:
Lấy đoạn chồi ngâm trong xà phòng 20 phút, rửa bằng nước dưới vòi và đưa vào box cấy. Mẫu cấy tiếp tục được ngâm trong cồn 70 độ trong 30 giây, sau đó tiến hành khử trùng với nuối thuỷ ngân HgCl2 0,1% có nhỏ thêm 3 giọt Tween 20 trong 20 phút, rửa mẫu bằng nước cất vô trùng 5 lần rồi đưa vào môi trường nuôi cấy.
Môi trường ở giai đoạn này ta sử dụng MS( Murashige and Skood medium , 1962); hoặc sử dụng Knudson C Orchid medium. Hầu hết các loại lan cần lượng khoáng rất ít nên ta sử dụng Knudson C, tuy nhiên môi trường MS quá phổ biến nên người ta thường sử dụng để nhân Lan.
B. Giai đoạn nhân nhanh:
Dùng Knudson thường + 0.6mg/L BAP hoặc 1mg/L Kinetin. Tuy nhiên BAP cho kết quả tốt hơn. Cũng có thể dùng 1/2MS vitamins + 0.6mg/L BAP.
C. Giai đoạn tạo rễ:
Trong quá trình tạo chồi cây cũng có rễ rồi nên không cần thiết phải thêm Auxins. Có thể thêm 100ml/L nước dừa cho quá trình kích thích tạo rễ.
– Than hoạt tính nên thêm ở mỗi giai đoạn: từ 2-3g/L – Đường đối với Lan này thì 20g/L. Thông thường sử dụng 30g/L vẫn được. – pH 5.8
Trong một bài nghiên cứu khác của Tiến Sỹ Dương Tấn Nhựt, sử dụng môi trường SH. A. Giai đoạn khởi tạo chồi: sử dụng SH + 1mg/L BA hoặc BAP sẽ cho kết quả tốt nhất. B. gian đoạn sinh trường và phát triển chồi ta sử dụng môi trường SH + 1mg/L BAP + 1mg/L NAA. Việc sử dụng riêng lẻ 1.g/L BAP cũng tạo ra rễ nhưng yếu hơn so với kết hợp NAA. Sự tổng hợp các diệp lục tố giúp sự quang hợp tốt hơn, chồi phát triển nhanh hơn, tăng kích thước và tạo nhiều rễ
Bạn đang đọc nội dung bài viết Nuôi Cấy Mô Invitro Lan Hài Paphiopedilum trên website Vitagrowthheight.com. Hy vọng một phần nào đó những thông tin mà chúng tôi đã cung cấp là rất hữu ích với bạn. Nếu nội dung bài viết hay, ý nghĩa bạn hãy chia sẻ với bạn bè của mình và luôn theo dõi, ủng hộ chúng tôi để cập nhật những thông tin mới nhất. Chúc bạn một ngày tốt lành!