Đề Xuất 6/2023 # Nghiên Cứu Nhân Giống In Vitro Lan Hoàng Thảo Phi Điệp Tím (Dendrobium Anosmum # Top 6 Like

Cập nhật nội dung chi tiết về Nghiên Cứu Nhân Giống In Vitro Lan Hoàng Thảo Phi Điệp Tím (Dendrobium Anosmum mới nhất trên website Vitagrowthheight.com. Hy vọng thông tin trong bài viết sẽ đáp ứng được nhu cầu ngoài mong đợi của bạn, chúng tôi sẽ làm việc thường xuyên để cập nhật nội dung mới nhằm giúp bạn nhận được thông tin nhanh chóng và chính xác nhất.

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊNTRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

NGUYỄN THU HƢỜNG

NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG IN VITROLAN HOÀNG THẢO PHI ĐIỆP TÍM(DENDROBIUM ASOMUM LINDL.)

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG

THÁI NGUYÊN – 2016

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊNTRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

NGUYỄN THU HƢỜNG

NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG IN VITROLAN HOÀNG THẢO PHI ĐIỆP TÍM

(DENDROBIUM ASOMUM LINDL.)Chuyên ngành: Công nghệ Sinh họcMã số: 60.42.02.01

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS. Nguyễn Thị Hải Yến

THÁI NGUYÊN – 2016

iLỜI CAM ĐOANTôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi thực hiện dướisự hướng dẫn của TS. Nguyễn Thị Hải Yến. Mọi trích dẫn trong luận văn đềughi rõ nguồn gốc. Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thựcvà chưa từng có ai công bố trong một công trình nào khác.Thái Nguyên, tháng 11 năm 2016Tác giả luận văn

Nguyễn Thu Hƣờng

iiLỜI CẢM ƠNLời đầu tiên tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới TS.Nguyễn Thị Hải Yến, Giảng viên Khoa Khoa học Sự sống, Trường Đại họcKhoa học Thái Nguyên, người đã trực tiếp hướng dẫn tận tình chu đáo và tạomọi điều kiện thuận lợi giúp tôi hoàn thành luận văn này.Đồng thời, tôi xin được cảm ơn các thầy, cô giáo và các cán bộ kỹ thuậtviên Phòng thí nghiệm Sinh học của Khoa Khoa học Sự sống đã tạo điều kiệnvề thời gian cũng như cơ sở vật chất cho tôi trong suốt quá trình học tập vàlàm luận văn thạc sĩ.Cuối cùng tôi xin cảm ơn gia đình, bạn bè cùng tất cả các thầy cô luônluôn động viên, khuyến khích và giúp đỡ tôi trong tiến trình tôi học tập và làmluận văn này.Trong quá trình làm luận văn không tránh khỏi những sai sót, tôi mongnhận được sự đóng góp quý báu từ phía thầy cô và bạn bè để tôi có thể cóđược kết quả tốt hơn.Thái Nguyên, tháng 11 năm 2016

Tác giả luận văn

Nguyễn Thu Hƣờng

iiiMỤC LỤCLỜI CAM ĐOAN …………………………………………………………………………………. iLỜI CẢM ƠN ……………………………………………………………………………………… iiMỤC LỤC ………………………………………………………………………………………….. iiiDANH MỤC TỪ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU …………………………………………… vDANH MỤC CÁC BẢNG……………………………………………………………………. viDANH MỤC CÁC HÌNH ……………………………………………………………………. viiMỞ ĐẦU ……………………………………………………………………………………………. 11. Đặt vấn đề………………………………………………………………………………………… 12. Mục tiêu nghiên cứu ………………………………………………………………………….. 23. Nội dung nghiên cứu …………………………………………………………………………. 2Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU …………………………………………………… 31.1. Giới thiệu chung về phong lan …………………………………………………………. 31.1.1. Chi lan Hoàng thảo (Dendrobium)…………………………………………………. 41.1.2. Lan Hoàng thảo phi điệp tím (Dendrobium anosmum Lindl.) …………… 71.1.3. Các phương pháp nhân giống trên cây lan ………………………………………. 91.2. Sơ lược về nuôi cấy mô tế bào thực vật …………………………………………… 101.2.1. Các hướng nghiên cứu ứng dụng và ưu thế của kĩ thuật nuôi cấymô – tế bào …………………………………………………………………………………………. 101.2.2. Các phương thức nuôi cấy mô tế bào trong nhân giống vô tính ……….. 111.2.3. Các giai đoạn của nhân giống in vitro…………………………………………… 121.2.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy mô ………………………….. 131.3. Một số nghiên cứu nhân giống in vitro lan Dendrobium ……………………. 141.3.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới ……………………………………………….. 151.3.2. Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam ……………………………………………… 16Chƣơng 2:

…………….. 18

2.1. Vật liệu ……………………………………………………………………………………….. 18………………………………………………………………………… 182.1.2. Dụng cụ và hóa chất …………………………………………………………………… 18

iv2.1.3. Thời gian và địa điểm nghiên cứu………………………………………………… 192.2. Phương pháp nghiên cứu ……………………………………………………………….. 192.2.1. Phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật …………………………………….. 192.2.2. Chuẩn bị môi trường nuôi cấy……………………………………………………… 202.2.3. Chuẩn bị một số thành phần bổ sung vào môi trường nuôi cấy ……….. 212.2.4. Chuẩn bị giá thể và ra cây …………………………………………………………… 212.2.5. Điều kiện nuôi cấy in vitro ………………………………………………………….. 212.2.6. Bố trí thí nghiệm ……………………………………………………………………….. 212.2.7. Các chỉ tiêu theo dõi …………………………………………………………………… 242.2.8. Xử lý số liệu ……………………………………………………………………………… 24Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN …………………………………………… 253.1. Kết quả khử trùng mẫu đưa vào nuôi cấy ………………………………………… 253.1.1. Kết quả khử trùng mẫu hạt phong lan …………………………………………… 253.2. Kết quả tái sinh chồi ……………………………………………………………………… 263.2.1. Kết quả tái sinh chồi từ hạt lan Hoàng thảo phi điệp tím ………………… 263.2.2. Kết quả nhân chồi từ protocorm lan Hoàng thảo phi điệp tím …………. 283.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của một số kích thích sinh trưởng nhómCytokinin đến sự nhân nhanh cụm chồi lan Hoàng thảo phi điệp tím ………… 293.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng khoai tây và chuối xanh đếnsự nhân nhanh lan Hoàng thảo phi điệp tím (Dendrobium AnosmumLindl.) ……………………………………………………………………………………………….. 333.5. Nghiên cứu ảnh hưởng α – NAA đến khả năng ra rễ Hoàng thảo phiđiệp tím ……………………………………………………………………………………………… 353.6. Ảnh hưởng chế phẩm dinh dưỡng đến sinh trưởng và phát triển củacây lan sau khi ra chai trồng trong bầu ………………………………………………….. 37KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ……………………………………………………………. 401. Kết luận …………………………………………………………………………………………. 402. Kiến nghị ……………………………………………………………………………………….. 40TÀI LIỆU THAM KHẢO …………………………………………………………………. 41

vDANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮTChữ viết tắt

Chữ viết đủ

ABA

Abscisic acid

ADN

Acid deoxyribonucleic

APG III

Angiosperm Phylogeny Group III

Thiamine

Riboflavin

BAP

6 – Benzyl adenin purine

ĐC

Đối chứng

EAC

Ehrlich ascites cells

GA3

Gibberellic acid

IAA

Indol – 3 – acetic acid

IBA

Indol – 3 – butyric acid

Kinetin

6 – furfurryl – aminopurin

KTST

Kích thích sinh trưởng

Murashige and Skoog

Phytamax

Robert Ernst

THT

Than hoạt tính

Vacin Went

USA

United States of America

2,4 – Dichlorophenoxy acetic acidα – Naphthalene acetic acid

Công thức

Thời gian

Khử trùng

viDANH MỤC CÁC BẢNGBảng 3.1. Kết quả khử trùng hạt lan Hoàng thảo phi điệp tím bằngHgCl2 0,1% …………………………………………………………………………. 25Bảng 3.2. Kết quả protocorm phát sinh từ hạt Hoàng thảo phi điệp tím …….. 27Bảng 3.3. Kết quả nhân chồi từ protocorm loài lan Hoàng thảo phi điệptím sau 50 ngày cấy chuyển …………………………………………………… 29Bảng 3.4. Ảnh hưởng của nhóm Cytokinin đến sự nhân nhanh chồi lanHoàng thảo phi điệp tím………………………………………………………… 30Bảng 3.5. Ảnh hưởng của hàm lượng chuối xanh và khoai tây nghiềnđến sự nhân nhanh cụm chồi lan Hoàng thảo phi điệp tím sau30 ngày ……………………………………………………………………………….. 34Bảng 3.6. Ảnh hưởng của α – NAA đến khả năng tạo rễ của lan Hoàngthảo phi điệp tím ………………………………………………………………….. 36Bảng 3.7. Ảnh hưởng chế phẩm dinh dưỡng đến sự sinh trưởng pháttriển của cây ………………………………………………………………………… 38

viiDANH MỤC CÁC HÌNHHình 1.1. Hoa và cây phong lan Hoàng thảo phi điệp tím ………………………….. 9Hình 2.1. Quả loài lan Hoàng thảo phi điệp tím ……………………………………… 20Hình 3.1. Hạt Hoàng thảo phi điệp tím nảy mầm trên môi trường MSchứa 2,0 mg/l BAP sau 30 ngày nuôi cấy ………………………………… 26Hình 3.2. Protocorm của lan Hoàng thảo phi điệp tím được tạo thành từhạt trên môi trường MS chứa 2,0 mg/l BAP …………………………….. 27Hình 3.3. Chồi phát sinh từ protocorm trên môi trường MS chứa 1,5 mg/l BAP …. 29Hình 3.4. Ảnh hưởng của BAP và kinetin tới sự nhân nhanh cụm chồilan Hoàng thảo phi điệp tím sau 60 ngày ………………………………… 33Hình 3.5. Ảnh hưởng của chuối xanh và khoai tây lên sự nhân nhanhcụm chồi lan Hoàng thảo phi điệp tím sau 60 ngày …………………… 35Hình 3.6. Ảnh hưởng của α – NAA đến khả năng tạo rễ của lan sau 30 ngày…. 37Hình 3.7. So sánh sự ảnh hưởng từ chế độ tưới ½ MS tới sinh trưởng vàphát triển của cây lan con so với đối chứng sau 60 ngày …………… 38

1MỞ ĐẦU1. Đặt vấn đềNgày nay, hoa cảnh không những đóng vai trò quan trọng trong đờisống tinh thần mà còn ảnh hưởng sâu sắc đến tâm hồn con người và làm đẹpcho cảnh quan môi trường. Do đó, quan tâm phát triển hoa cảnh là vấn đề cầnthiết. Hoa lan là một trong những loại hoa được ưa chuộng nhất vì hình dáng,màu sắc, kích thước phong phú, đa dạng nên chúng được trồng, sản xuất kháphổ biến và đã trở thành một mặt hàng có giá trị trong kinh doanh, xuất khẩutrên thế giới. Các nước có ngành nuôi trồng hoa lan phát triển, hàng năm kimngạch xuất khẩu lên đến hàng trăm triệu USD [15].Việt Nam là một quốc gia thuộc vùng khí hậu nhiệt đới thích hợp chosự phát triển của các loài phong lan. Theo cuốn Phong lan Việt Nam của TrầnHợp thì nước ta có 137 – 140 chi với trên 1000 loài phong lan, mỗi loài lanđều có vẻ đẹp riêng. Lan rừng tuy không rực rỡ về màu sắc như những giốnglan ngoại nhập nhưng lại có vẻ đẹp tự nhiên thanh thoát và phần lớn có hươngthơm vì vậy luôn được người chơi lan ưa chuộng. Thế giới lan rừng rất phongphú với nhiều chủng loại, một trong những chi phổ biến nhất là chi Hoàngthảo (Dendrobium). Hiện nay, Dendrobium được trồng nhiều và có giá trịkinh tế cao bởi bên cạnh giá trị thẩm mỹ mà Dendrobium đem lại thìDendrobium còn được tách chiết để phục vụ cho một số ngành công nghiệpmỹ phẩm, y học. Với giá trị như vậy hoa lan Dendrobium hứa hẹn sẽ mang lạinguồn doanh thu to lớn cho ngành sản xuất, kinh doanh mặt hàng này.Trên thị trường hiện nay, phong lan chủ yếu được cung cấp dưới dạngcây giống khai thác từ rừng, còn hạt lan rất khó nảy mầm ở điều kiện tự nhiênvì vậy số lượng cây con mọc ra không nhiều. Ngày nay, với công nghệ nhângiống in vitro, người ta có thể tạo ra từ vài nghìn đến hàng triệu cây con ổnđịnh về mặt di truyền từ một quả lan, từ đó góp phần bảo tồn và phát triểnnguồn gen của các loài lan Việt Nam. Nhờ ứng dụng nhân giống in vitro vàochi Dendrobium đã làm cho nó trở thành một loài hoa cắt cành hiệu quả.

2Từ các lý do trên, chúng tôi đã tiến hành đề tài “Nghiên cứu nhângiống in vitro lan Hoàng thảo phi điệp tím (Dendrobium anosmum Lindl.)”nhằm mục đích góp phần bảo tồn và nhân nhanh giống lan rừng bằng phươngpháp in vitro.2. Mục tiêu nghiên cứuNghiên cứu quy trình nhân nhanh giống loài lan rừng Dendrobiumanosmum Lindl. (Hoàng thảo phi điệp tím) nhằm bảo tồn nguồn gene quýhiếm và nhân giống lan rừng Việt Nam bằng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào.3. Nội dung nghiên cứu– Nghiên cứu đưa mẫu lan Hoàng thảo phi điệp tím vào nuôi cấy in vitro.– Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất kích thích sinh trưởng thựcvật lên quá trình tái sinh chồi từ phôi hạt của loài lan Hoàng thảo phi điệp tím.– Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất kích thích sinh trưởng thuộcnhóm cytokinin lên quá trình nhân nhanh lan Hoàng thảo phi điệp tím(Dendrobium anosmum Lindl.).– Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng khoai tây và chuối xanh đến sựnhân nhanh lan Hoàng thảo phi điệp tím (Dendrobium Anosmum Lindl.)– Nghiên cứu ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng thuộc nhómauxin lên quá trình hình thành rễ lan Hoàng thảo phi điệp tím (Dendrobiumanosmum Lindl.).– Tìm hiểu tác dụng của một số chế phẩm lên sự sinh trưởng và pháttriển của lan Hoàng thảo phi điệp tím (Dendrobium anosmum Lindl.) sau khira cây trồng trong bầu.Đề tài được thực hiện tại phòng thí nghiệm sinh học thuộc Khoa Khoahọc Sự sống, trường Đại học Khoa học, Đại học Thái Nguyên.

4đến một kích thước nào đó sẽ phát triển thêm lá và rễ tạo nên một thân cây.Thân cây cứ phát triển theo cách này tạo nên một tập hợp phân nhánh cácthân cây mọc từ cây gốc ban đầu gọi là cây đa thân, ví dụ như chi lanCattleya, Dendrobium…[4], [17].Dựa theo khả năng thích nghi với điều kiện môi trường họ lan đượcchia thành 4 nhóm chính:Phong lan (Epiphyte): Là loài sống ký gửi nhờ vào thân cây cao ẩmmục ở trong rừng hoặc trên núi cao, rễ bám vào các cây to, thân rủ xuống.Địa lan (Terrestrial): Là loài có thân giả dạng củ, rễ chùm sống nhờđất ở sườn núi, bờ suối hay dưới tán rừng ẩm ướt. Địa lan có nhiều loài vớihình dáng, màu sắc phong phú đẹp mắt.Hoại lan (Saprophyte): Gồm những loại mọc trên rêu và gỗ mục.Thạch lan (Lithophyte): Gồm một số loại mọc trên đá.1.1.1. Chi lan Hoàng thảo (Dendrobium)1.1.1.1. Phân loại chi lan Hoàng thảoChi lan Hoàng thảo (Dendrobium) là chi lan lớn thứ 2 trong họ hoa lanđứng sau lan lọng. Lan Hoàng thảo rất phong phú và đa dạng với hơn 1600loài, phân bố ở các vùng Châu Úc, Châu Á tập trung nhiều nhất ở Đông NamÁ. Lan Hoàng thảo rất đa dạng về cấu tạo sinh học, hình thái và phong phú vềdạng cây, dạng hoa. Vì vậy các nhà khoa học đã chia thành 40 nhóm nhỏ đểtiện cho việc nghiên cứu và trồng trọt. Trong đó tiêu biểu nhất là các nhóm:Nhóm thứ nhất có đặc điểm là lá xanh quanh năm, hoa thường mọc ởgần ngọn có nhiều màu sắc sặc sỡ như: Dendrobium bigibbum, Dendrobiumphalaenopsis…[17]Nhóm thứ hai có đặc điểm là các giả hành buông thõng xuống, mangnhiều lá xanh hai bên, hoa mọc thành từng chùm hoặc từng hoa như:Dendrobium anosmum, Dendrobium aphyllum…Nhóm thứ ba có đặc điểm là hoa mọc ở đỉnh, buông thõng xuống và có

5mùi thơm như: Dendrobium farmeri, Dendrobium chrysotoxum…Nhóm thứ tư có đặc điểm là chùm hoa mọc thẳng đứng, màu xanh hoặcmàu vàng như: Dendrobium atroviolaceum, Dendrobium spetabile…Nhóm thứ năm có đặc điểm là giả hành mọc thẳng đứng có một lớplông bao phủ như: Dendrobium draconis, Dendrobium formosum…[17]Bên cạnh đó, có thể căn cứ vào đặc điểm sinh trưởng và dạng thân, lanDendrobium được chia thành 2 nhóm chính:Nhóm thân mềm: Có đặc điểm là các giả hành buông lõng hoặc rủxuống, thường thấy ở vùng khí hậu lạnh, gồm các giống được lấy ở vùng caonguyên Việt Nam, Miến Điện…, trên độ cao 1000 m.Nhóm thân cứng: Mọc thẳng đứng thường ở vùng nóng hơn (Malaysia,Indonexia…).Ngoài ra còn một nhóm Dendrobium trung gian có thể sống ở cả vùngnóng lạnh như: Dendrobium primulimun, Dendrobium farmeri… [17].1.1.1.2. Các điều kiện cơ bản để nuôi trồng lan DendrobiumÁnh sáng: Lan cần nhiều ánh sáng gần như có thể để ở ngoài trờinhưng cần phải có lưới che phòng khi lá non bị cháy nắng. Khi thấy cây quặtquẹo, đó là dấu hiệu thiếu nắng, nếu thiếu nắng cây khó ra hoa.Nhiệt độ: Lan cần nuôi trong nhiệt độ từ 8 – 25°C tuy nhiên lan có thểchịu nóng tới 38°C và có thể chịu lạnh tới 3,3°C. Ngoài ra nếu vào mùa đônglạnh dưới 15,6°C trong vòng 4 – 6 tuần lan sẽ khó ra nụ.Độ ẩm và thoáng gió: Lan mọc mạnh nếu độ ẩm từ 60 – 70%. Nếu độẩm quá thấp cây non sẽ không lớn được và bị teo đi. Cây cũng không mọcmạnh nếu không thoáng gió và trong thời kỳ lan ra nụ nếu không thoáng giónụ sẽ ít đi.Giá thể: Với một số loài lan trồng không cần dùng đến giá thể vẫn sinhtrưởng tốt, nhưng nếu môi trường sống có giá thể vẫn tốt hơn. Giá thể của langồm những thứ dễ kiếm, có sẵn trong tự nhiên. Những chất liệu này không

6phải vùng nào cũng giống nhau và chúng được chọn tùy theo điều kiện ngoạicảnh, nhân lực, loài lan và quy mô sản xuất. Những loại giá thể thường sửdụng như vỏ thông, vỏ dừa, rêu…Tưới nước: Vào mùa hè khi lan ra mầm non và mọc mạnh, tưới 2 – 3lần một tuần. Vào mùa thu, khi cây đã ngừng tăng trưởng nên tưới nước thưađi, mỗi tuần chỉ cần tưới 1 lần cho thân cây khỏi bị teo lại. Vào mùa đông,đây là thời gian lan chuẩn bị để ra hoa, ngưng hẳn việc tưới nước. Nếu độ ẩmquá thấp nên phun sương mỗi tháng 1 – 2 lần [19].1.1.1.3. Sâu bệnh và các vấn đề khácVì lan Dendrobium cần được bón nhiều loại phân hữu cơ khác nhau vàmôi trường giá thể sẽ mục nát sau một thời gian trồng cây nên đã tạo điều kiệncho nhiều loài sâu bệnh gây hại, một số bệnh thường gặp và cách điều trị:Bệnh đen thân cây lan: Do nấm Fusarium gây nên, cách phòng trị làtách những cây bị bệnh để riêng và dùng thuốc phòng trừ hay nhúng cả câyvào thuốc trị nấm. Với cây lớn hơn thì cắt bỏ phần thối rồi phun thuốc diệtnấm như Carboxin 1/2000; Zineb 3/2000; Benlat 1/2000 [18].Bệnh đốm lá: Do nấm Cercospora gây nên, bệnh thường phát sinhmạnh trên cây lan Dendrobium, gây hại trong mùa mưa ở những vườn lan cóđộ ẩm cao, phòng trừ bằng các thuốc diệt nấm như Carboxin 1/2000; Zineb3/2000; Benlat 1/2000 [18].Bệnh thán thư: Do nấm Collectotrichicum gây ra. Bệnh phát triển mạnhvào mùa mưa nên phải phòng trừ trước, thường cắt bỏ lá vàng rồi phun thuốcdiệt nấm 5 – 7 ngày/lần [18].Bệnh thối mềm vi khuẩn: Do vi khuẩn Pseudomonas gladioli gây ra.Vết bệnh có hình dạng bất định, ủng nước, màu trắng đục, thường lan rộngtheo chiều rộng của lá. Gặp thời tiết ẩm ướt mô bệnh bị thối úng, thời tiết khôhanh mô bệnh khô tóp có màu trắng xám [18].Để phòng trừ bệnh do nấm, trước hết cần bảo đảm cho cây đủ dinhdưỡng và tỷ lệ N:P:K cân đối. Dư N và thiếu K thường làm cho lá mềm, dễ

7nhiễm bệnh. Ánh sáng phải đầy đủ để giữ độ cứng cho lá. Lá bị gãy do dư N,thiếu K hay do thiếu ánh sáng. Không tưới dư nước vì dễ làm cho rễ úng vàthối. Phun thuốc phòng ngừa thường xuyên 1 tháng 1 – 2 lần. Nếu thấy bệnhxuất hiện cần phun nhiều hơn (2 – 3 lần/tuần) cho đến khi triệu chứng bệnhgiảm thì trở lại phun theo cách phòng ngừa [18].Sâu hại lan: Rệp vảy thường bám trên các thân giả hành còn non,phòng trị bằng cách dùng bàn chải chà xát rồi phun dung dịch thuốcMalathion 50 pha loãng; Bọ trĩ gây hại chủ yếu trong mùa nắng, dùngMalathion 5 mg/bình 4 lít nước, phun 1lần / tuần, phun liên tiếp liên tục trong3 tuần [19] .1.1.2. Lan Hoàng thảo phi điệp tím (Dendrobium anosmum Lindl.)1.1.2.1. Phân loạiCó nhiều cách phân loại cho Hoàng thảo phi điệp tím, theo hệ thốngAPG III thì lan được phân loại như sau:Giới: Thực vật (Plantae)Ngành: Thực vật hạt kín (Angiospermae)Lớp: Một lá mầm (Monocotylendons)Bộ: Măng tây (Asparagales)Họ: Phong lan (Orchidaceae)Phân họ: Lan biểu sinh (Epidendroideae)Chi: Hoàng thảo (Dendrobium)Loài: Phi điệp tím (Dendrobium anosmum Lindl.)Tên khoa học của lan Hoàng thảo phi điệp tím được nhiều nhà khoahọc công nhận là Dendrobium anosmum Lindl.[3].1.1.2.2. Đặc điểm sinh học– Rễ của Hoàng thảo phi điệp tím thuộc loại rễ bì sinh, xung quanh rễthật được bao bọc bởi một lớp mô xốp giúp cây dễ dàng hút nước, muối

8khoáng và ngăn chặn ánh sáng mặt trời gay gắt. Chóp rễ có màu xanh lá cây,ở phần rễ có các sắc lạp không bị ngăn bởi mô xốp nên có thể giúp câyquang hợp.– Thân của Hoàng thảo phi điệp tím thuộc nhóm lan thân có giả hành.Giả hành chứa diệp lục, dự trữ nước và chất dinh dưỡng cần thiết cho sự pháttriển của giả hành mới. Cấu tạo của giả hành gồm nhiều mô mềm chứa đầydịch nhầy, phía ngoài có lớp biểu bì với vách tế bào dày, nhẵn bóng bảo vệ đểtránh sự mất nước do mặt trời hun nóng. Củ giả hành có màu xanh bóng nêncùng với lá nó cũng làm nhiệm vụ quang hợp [4].– Lá là cơ quan dinh dưỡng của hoa lan, là xưởng chế tạo chất dinhdưỡng bằng quang hợp. Xếp thành hai dãy đối nhau trên thân (lá đối), lá cóhình xoang, các gân lá chính chạy song song và các khe lõm xuống, lá rụngtạo thành các giả hành.– Hoa không những mọc trên những giả hành mới mà còn mọc trên cácgiả hành cũ. Trên cánh có phủ lông mịn và có ánh kim, trên lưỡi thường cóhai mặt tím đậm, hương thơm ngào ngạt. Bên trong hoa có cột nhị nhụy nằmchính giữa hoa mang phần đực ở phía trên và phần cái ở phía trước mặt. Nhịgồm hai phần bao phấn và hốc phấn. Bao phấn nằm ở cột nhị nhụy còn hốcphấn thì lõm lại mang khối phấn và thường song song với bao phấn. Khốiphấn gồm toàn bộ hạt phấn dính lại với nhau, rất cứng.– Quả của Hoàng thảo phi điệp tím thuộc loại quả nang nở ra theo 3 – 6đường nứt dọc, khi chín quả nở ra, mảnh vỏ còn dính lại với nhau ở phía đỉnhvà phía gốc. Bên trong chứa rất nhiều hạt, khi chín hạt có màu vàng. Hạt cấutạo bởi một phôi chưa phân hóa, trên một máng lưới nhỏ, xốp chứa đầy khôngkhí. Hạt rất nhiều và nhỏ, toàn bộ hạt trong một quả nặng chỉ bằng một phầnmười mg, rất nhẹ nên dễ phát tán nhờ gió [4], [5].1.1.2.3. Phân bốHoàng thảo phi điệp tím có nguồn gốc rộng lớn khắp châu Á, từ miềnNam Nhật Bản đến các chân đồi phía Himalaya, bán đảo Đông Dương,

9Malaysia, Indonexia… Ở Việt Nam, loài này phân bố trên khắp các núi rừngtừ Bắc tới Nam: Đô Lương, Đà Lạt, Đắk Lắc, Hòa Bình… [16].

Hình 1.1. Hoa và cây phong lan Hoàng thảo phi điệp tím1.1.3. Các phương pháp nhân giống trên cây lan1.1.3.1. Các phương pháp nhân giống truyền thốngNhân giống vô tínhTách bụi: Phương pháp này dùng để tách các chậu lan quá đầy, đồngthời làm tăng số lượng cây mới. Các giả hành già được tách ra khi hoa đã tànvà chỉ tách khi đã trồng được từ 2 – 3 năm. Giả hành già được ươm lại trên giáthể ẩm để tạo chồi con, các chồi con được nuôi cùng với giả hành cho đến lúcđã tạo ra rễ mới, đủ sức phát triển mới tách lần thứ hai, từ một giả hành có thểcho mỗi đợt 1 – 2 cây con [5].Chiết cành: Ở Dendrobium thường tạo ra cây con trên giả hành mộtcách tự nhiên. Khi các cây con phát triển khá mạnh, có rễ tốt có thể tách rakhỏi giả hành để trồng. Phương pháp chiết tách đảm bảo được tính chất ditruyền của cây bố mẹ nhưng lại cho một thế hệ cây con sinh trưởng khôngđồng đều nên khó cung cấp một số lượng cây con lớn để phục vụ cho nuôitrồng với quy mô lớn.

10Nhân giống hữu tính: Trong thiên nhiên sự thụ phấn ở lan do côntrùng thực hiện do cấu trúc của hoa lan là hoàn toàn để thích nghi cho sự thụphấn ấy. Có 2 phương pháp thụ phấn:Sự tự thụ phấn: Khi phấn hoa của bông hoa này được rơi trên númnhụy của chính hoa ấy. Điều này hiếm khi xảy ra trong tự nhiên ở hoa lan vìcấu trúc của bộ phận sinh dục đực và cái ở hoa lan.Sự thụ phấn chéo: Khi phấn hoa ở hoa này rơi vào núm nhụy của hoahác của cùng một cây hay cùng loài hoặc khác loài, khác giống.Nếu sự thụ phấn có kết quả thì có thể ngay trong ngày hay sang ngàyhôm sau, các phiến hoa co lại nhưng không rụng và để tránh sự thụ phấn khácdo côn trùng người ta dùng bao nilon trùm lại nhưng không buộc kín miệng vìhầm hơi sẽ làm hư trái. Sau khi thụ phấn, bầu noãn từ từ trương, phình to rathành trái, mỗi trái có thể chứa hàng ngàn đến triệu hạt. Khi trái từ màu xanhlục chuyển sang màu vàng lục thì nên hái trái.Trong thiên nhiên muốn hạt lan nảy mầm được thì hạt lan phải đượcnhiễm một số loại nấm cộng sinh. Người ta đã khám phá ra một số loài nấmgiúp hạt lan nảy mầm, mỗi loài chỉ giúp nảy mầm ở một số giống lan như:Rhizoctonia repens giúp nảy mầm Cattleya, Cypripedium, Dendrobium;Rhizoctonia mucoroudes giúp nảy mầm Vanda, Phalaenopsis; Rhizoctonialanugiosa giúp cho hạt nảy mầm ở Oncidium [3].Nhân giống in vitroNgày nay với công nghệ nhân giống in vitro, từ một quả lan có thể tạora từ vài nghìn đến hàng triệu cây con ổn định về mặt di truyền, đồng thời cóchất lượng tốt và đáp ứng nhu cầu ngày càng cao của thị trường.1.2. Sơ lƣợc về nuôi cấy mô tế bào thực vật1.2.1. Các hướng nghiên cứu ứng dụng và ưu thế của kĩ thuật nuôi cấy mô– tế bàoNhân giống in vitro là một trong những ứng dụng chính của công nghệtế bào thực vật, sử dụng môi trường nhân tạo để nhân đỉnh sinh trưởng hoặccác mô phân sinh trong cây[1].

11Mục đích của kĩ thuật nhân nhanh giống đó là: (1) Duy trì và nhânnhanh các kiểu gen quý làm vật liệu cho công tác chọn giống; (2) Duy trì vànhân nhanh các cá thể đầu dòng tốt để cung cấp hạt giống các cây trồng khácnhau; (3) Nhân nhanh với điều kiện vô trùng cách ly tái nhiễm kết hợp vớiviệc làm sạch bệnh cho cây; (4) Rút ngắn thời gian đưa các cây lai và các loàitự nhiên có đặc điểm tốt vào sản xuất hoặc nhân nhanh bố mẹ của các cặp laitrong sản xuất; (5) Bảo quản tốt tập đoàn giống vô tính về các loài cây giaophấn trong ngân hàng gen [1].Vì vậy, nuôi cấy mô – tế bào đã mang lại hiệu quả hết sức to lớn nhờ cócác ưu thế, đó là: (1) Hệ số nhân giống cao rút ngắn thời gian đưa con giống vàosản xuất. Trong phần lớn các trường hợp công nghệ nuôi cấy mô tế bào đảm bảotốc độ nhân nhanh, từ một cây trong vòng 1 – 2 năm có thể tạo thành hàng triệucây; (2) Nhân được một số lượng cây lớn trong một diện tích nhỏ; (3) Làm sạchbệnh cây trồng và cách ly chúng với các nguồn bệnh; (4) Thuận tiện việc vậnchuyển và bảo quản; (5) Sản xuất quanh năm, quy trình sản xuất có thể được vậnhành trong bất cứ thời gian nào trong ngày, mùa nào trong năm.1.2.2. Các phương thức nuôi cấy mô tế bào trong nhân giống vô tínhNuôi cấy mô phân sinh hoặc đỉnh sinh trưởng: Ở lan có sự phát triểncùng một lúc đỉnh sinh trưởng tạo hàng loạt protocrom sau đó tiếp tục phânchia cho ra các protocrom mới hay các chồi mới tạo thành cây hoàn chỉnh.Tái sinh cây hoàn chỉnh từ các bộ phận khác của cây: Ngoài mô phânsinh và đỉnh sinh trưởng là bộ phận dễ nuôi cấy thành công, các bộ phận còn lạicủa một cơ thể thực vật đều có thể ứng dụng cho nuôi cấy mô – tế bào như cácđoạn thân, cuống lá, các bộ phận của hoa, nhánh củ…Nhân giống qua giai đoạn mô sẹo: Trong khuôn khổ mục đích nhângiống vô tính, nếu tái sinh được cây hoàn chỉnh trực tiếp từ mẫu cấy ban đầu thìkhông những nhanh chóng thu được cây mà các cây cũng khá đồng nhất về mặtdi truyền.

121.2.3. Các giai đoạn của nhân giống in vitroGiai đoạn 1: Khử trùng mô nuôi cấyĐây là giai đoạn tối quan trọng quyết định toàn bộ quá trình nhân giốngin vitro. Mục đích của giai đoạn này là phải tạo ra được nguyên liệu vô trùngđể đưa vào nuôi cấy in vitro [1], [11].Giai đoạn 2: Tái sinh mẫu nuôi cấyMục đích của giai đoạn này là tái sinh một cách định hướng các mônuôi cấy. Quá trình này được điều khiển chủ yếu dựa vào tỉ lệ của các hợpchất auxin, cytokynin ngoại sinh đưa vào môi trường nuôi cấy [1], [11].Giai đoạn 3: Nhân nhanhGiai đoạn này được coi là giai đoạn then chốt của quá trình. Để tăng hệsố nhân, ta thường đưa thêm vào môi trường dinh dưỡng nhân tạo các chấtđiều hoà sinh trưởng (auxin, cytokynin, gibberellin…), các chất bổ sung khácnhư nước dừa, dịch chiết nấm men,… kết hợp với các yếu tố nhiệt độ, ánhsáng thích hợp [1], [11].Giai đoạn 4: Tạo cây hoàn chỉnhKhi đạt được kích thước nhất định, các chồi được chuyển từ môi trườngở giai đoạn 3 sang môi trường tạo rễ. Thường 2 – 3 tuần, từ những chồi riêngl này sẽ xuất hiện rễ và trở thành cây hoàn chỉnh. Ở giai đoạn này người tathường bổ sung vào môi trường nuôi cấy các auxin là nhóm hormon thực vậtquan trọng có chức năng tạo rễ phụ từ mô nuôi cấy [1], [11].Giai đoạn 5: Đưa cây ra giá thểGiai đoạn đưa cây hoàn chỉnh từ ống nghiệm ra ngoài môi trường lbước cuối cùng của quá trình nhân giống in vitro và là bước quyết định khảnăng ứng dụng quá trình này trong thực tiễn sản xuất. Đây là giai đoạnchuyển cây con in vitro từ trạng thái sống dị dưỡng sang sống hoàn toàn tựdưỡng, do đó phải đảm bảo các điều kiện ngoại cảnh phù hợp để cây con đạttỉ lệ sống cao trong vườn ươm cũng như ruộng sản xuất [1], [11].

131.2.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy môMô nuôi cấy:Mỗi tế bào ở mỗi mô khác nhau có khả năng tạo mô sẹo, phân hóathành rễ, thân, cành, lá… rất khác nhau. Việc chọn mẫu thực vật để sử dụngtrong quá trình nuôi cấy có vai trò quyết định nếu chọn sai mẫu chúng ta sẽkhông thu nhận được kết quả hoặc thu được những cây sẽ không phát triểnmạnh, thậm chí cây có thể ngừng phát triển ở một giai đoạn nhất định.Điều kiện vô trùng:Môi trường nuôi cấy mô thực vật có các thành phần thích hợp cho cácloại nấm, vi khuẩn phát triển. Vì vậy, điều kiện tiên quyết là phải đảm bảonguyên tắc vô trùng cho mẫu cấy, môi trường cấy và các trang thiết bị liênquan trong suốt quá trình nuôi cấy, tất cả các thao tác nuôi cấy, cấy chuyển…cũng phải thực hiện trong điều kiệ

1].

Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng:Nguồn cacbon: Nguồ

đường sucrose,

glucose, maltose, galactose. Cung cấp năng lượng cho nuôi cấy đồng thờiđóng vai trò duy trì áp suất thẩm thấu của môi trường [1], [10].Thành phần khoáng: Các nguyên tố đa lượng như: N, P, S, K, Mg,Ca… được sử dụng ở nồng độ trên 30 mg/l và thường tồn tại dưới các dạngmuối NH4+, NaH2PO4, KNO3, KCl… Các nguyên tố vi lượng như: Mn, Bo,Zn, Cu, Ni… được cung cấp với hàm lượng nhỏ hơn 30 mg/l [1], [10].Vitamin: Để cây phát triển được tối ưu ta cần bổ sung từ bên ngoài cácvitamin như: Vitamin B1, B2; myo-inositol; biotin; pantothenic acid…Nước: Nước là thành phần quan trọ

ấy, nó

chiếm khoảng 95% trong môi trường dinh dưỡng.Agar: Hàm lượng agar thường dùng cho môi trường nuôi cấy dao độngtừ 0,6 – 1,0% theo khối lượng.Than hoạt tính: Nồng độ sử dụng thường là từ 0,2 – 3%. Than hoạ

14hấp thụ độc tố nâu/đen và các độc tố không màu khác; hấp thụcác hợp chất hữu cơ khác (auxin, cytokinin, ethylene, vitamin…); thúc đẩy sựtạo phôi soma, ổn định độ pH [1], [10].Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật:Là thành phần không thể thiếu trong môi trường nuôi cấy, có vai tròquan trọng trong quá trình phát sinh hình thái thực vật in vitro. Hiệu quả tácđộng của chất điều hoà sinh trưởng phụ thuộc vào: nồng độ sử dụng, hoạt tínhvốn có của chúng và nguồn gốc mô cấy…Chất điều hoà sinh trưởng (phytohormon) được chia làm hai nhóm chấtcó tác dụng đối kháng về sinh lý đó là: nhóm chất kích thích sinh trưởng vànhóm chất ức chế sinh trưởng. Đối với nhóm chất kích thích sinh trưởng gồmcó 3 nhóm chính đó là: auxin, gibberellin và cytokinin được sử dụng chủ yếutrong nuôi cấy. Còn các chất thuộc nhóm ức chế sinh trưởng gồm có ABA,etilen, các hợp chất phenol, các chất ức chế tổng hợp như retardant, các chấtdiệt cỏ… Bên cạnh các chất điều hoà sinh trưởng, người ta còn bổ sung thêmcác dung dịch hữu cơ có thành phần phức tạp và không xác định như: dịchchiết nấm men, nước ép khoai tây, chuối, nước dừa, cazein thuỷ phân… nhằmtăng cường sự sinh trưởng và phát triển của mô cấy [10].Ảnh hƣởng củ

ật lí:

Nhiệt độ thông thường trong phòng thí nghiệm nhiệt độ được duy trìbằng máy điều hoà ở 25 ± 2 C phù hợp với đa số mô cấy; ánh sáng có ảnhhưởng mạnh tới quá trình phát sinh hình thái của mô nuôi cấy bao gồm cườngđộ, chu kỳ và thành phần quang phổ ánh sáng (Read, 1990; Dooley, 1991).Cường độ ánh sáng trắng từ 1000 – 2500 lux, với chu kỳ 16/24 giờ chiếu sángđược dùng phổ biến cho nhiều mô nuôi cấy; pH của môi trường nuôi cấythường ở khoảng 5,8 – 6 thì tốt trong nuôi cấy mô [10].1.3. Một số nghiên cứu nhân giống in vitro lan DendrobiumPhong lan là một trong những loại cây trồng có nhiều thành công nhất

15trong nhân giống vô tính bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào. Trên thế giớicũng như tại Việt Nam đã có rất nhiều công trình về nhân nhanh các giống lannhằm bảo tồn và tăng số lượng phục vụ sản xuất. Với việc sử dụng kĩ thuậtnhân giống đã tạo ra sự phát triển vượt bậc nghề trồng lan ở quy mô lớn.1.3.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giớiTháng 8/2010, Maridass M. và cộng sự đã tiến hành nhân giống in vitrophong lan Dendrobium nanum từ nguồn vật liệu ban đầu là thân rễ. Nghiêncứu này được đăng trên Tạp chí Công nghệ sinh học quốc tế (2010). Vật liệuthân rễ được rửa bằng nước cất, rửa qua ethanol 70% trong 30 giây, tiếp theokhử trùng với hyponatri 3% (bổ sung 2 – 3 giọt Tween80 EAC) trong 20 phútvà sau đó rửa sạch cho 4 – 5 lần bằng nước cất vô trùng. Thân rễ được chẻ racắt miếng nhỏ (5 mm) và các mảnh rễ được cấy trên môi trường cơ bản củaMS bổ sung các chất KTST như NAA, BAP và kinetin. Các mẫu hình thànhprotocorm tốt trên môi trường MS + kinetin 1,2μM + NAA 2.0μM. Sau đóprotocorm phát sinh chồi tốt nhất trên môi trường MS + BAP 0.5μM [14].Năm 2011, Sana A. và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu nhân nhanhchồi giống lan Dendrobium nobile var. Emma từ chồi nách, sử dụng môitrường có bổ sung BAP ở các nồng độ khác nhau 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5 và 3,0mg/l và kinetin. Qua nghiên cứu các tác giả nhận thấy ở môi trường có chứaBAP 1,5 mg/l kết hợp với kinetin cho kết quả nhân chồi cao nhất. Tạo câyhoàn chỉnh tốt nhất trên môi trường chứa IBA 2 mg/l với tỷ lệ phần trăm tạorễ (97,5%), số lượng rễ (4,70) và chiều dài cây (3,47 cm) hiệu quả hơn so vớiNAA. Nồng độ cao hơn của IBA và NAA (3,0 mg/l) cho thấy khả năng hìnhthành rễ kém [15].Bijaya P. và Deepa T. (2012) khi nghiên cứu nhân nhanh giốngDendrobium primulinum Lindl. đã nhận thấy: Thông qua việc nuôi cấy cácđỉnh chồi có kích thước từ 0,3 đến 0,5 mm trên môi trường MS cơ bản và môitrường MS bổ sung kết hợp các chất NAA, BAP ở các nồng độ khác nhau,

16các protocorm hình thành đã tạo chồi và rễ. Sau 5 tuần nuôi cấy số lượng chồităng nhanh nhất trên môi trường MS + BAP 1,5 mg/l + NAA 0,5 mg/l. Trongthí nghiệm tạo rễ, rễ được quan sát sau 3 tuần cấy thấy trên môi trường MS +IAA 0,5 mg/l, cây lan ra rễ tốt nhất. Khi ra cây trên giá thể đất sạch và rêu(dớn) tỷ lệ 2:1 thì gần 70% cây con sống sót [13].1.3.2. Tình hình nghiên cứu tại Việt NamPhong lan Việt Nam có số lượng chi và loài phong phú, dần trở thànhmột họ cây có giá trị tài nguyên và kinh tế bậc nhất trong các họ cây rừng.Việt Nam trong những năm gần đây đã có rất nhiều đề tài nhân giống phonglan đặc biệt là các cây lan có giá trị như các nghiên cứu:Bùi Thị Tường Thu và cộng sự (2007), khi nghiên cứu sự ảnh hưởngcủa chất điều hòa sinh trưởng đến quá trình phát sinh phôi và tế bào đã đưa ramột số kết quả về lan Dendrobium như sau: Mẫu nuôi cấy ban đầu là chồinon, được cắt thành lát mỏng, nuôi cấy trên môi trường VW + saccharose 20g/l + nước dừa 100 ml/l + peptone 1 g/l + BA 1 mg/l + NAA 0,3 mg/l + AC 1g/l. Sau thời gian nuôi cấy 30 ngày, tế bào soma phát sinh trên vết cắt, tỷ lệtạo soma là 100% trên các mẫu nuôi cấy. Tế bào soma màu trắng sáng, đượctiến hành nhân sinh khối trên 6 môi trường thực nghiệm và kết quả thu đượctế bào soma tăng sinh mạnh mẽ trên môi trường VW + BA 1 mg/l + NAA 0,3mg/l + nước dừa 100 ml/l [8].Nguyễn Thanh Tùng và cộng sự (2010) đã áp dụng phương pháp nuôicấy lát mỏng tế bào trong nhân giống in vitro cây Hoàng thảo thân gãy(Dendrobium aduncum). Trong nghiên cứu của nhóm tác giả này, vật liệukhởi đầu là chồi in vitro được cắt lát mỏng theo chiều ngang. Kết quả chothấy mẫu cảm ứng tốt trên môi trường ½ MS + BA 0,5 mg/l và tái sinh tốttrên môi trường MS + kinetin 3 mg/l + NAA 0,3 mg/l. Từ protocorm tỷ lệchồi đạt được 5,67 chồi/mẫu [9].Nghiên cứu nhân nhanh in vitro giống lan Hoàng thảo phi điệp tím

Nghiên Cứu Nhân Giống In Vitro Lan Trầm Tím (Dendrobium Nestor)

Công nghệ sinh học & Giống cây trồng NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG IN VITRO LAN TRẦM TÍM (Dendrobium nestor) Vũ Thị Phan1, Khuất Thị Hải Ninh2, Nguyễn Thị Thơ3 1,2,3 Trường Đại học Lâm nghiệp TÓM TẮT Nhân giống cây lan Trầm tím (Dendrobium nestor) bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro đã được nghiên cứu thành công. Kết quả cho thấy, khử trùng quả lan bằng phương pháp đốt 3 lần bằng cồn 960 cho tỷ lệ nảy mầm 90,8% sau 8 tuần nuôi cấy. Nhân nhanh thể chồi trên môi trường MS bổ sung 0,4 mg/l BAP; 0,2 mg/l NAA; 0,2 mg/l Kinetin; 30g/l sucrose; 5,5 g/l agar, hệ số nhân đạt 6,33 lần sau 6 tuần nuôi cấy. Kích thích tăng trưởng chồi bằng môi trường nhân nhanh thể chồi bổ sung 100 mg/l khoai tây cho hệ số nhân chồi là 4,12 lần, chiều cao chồi đạt 4,23 cm, thân mập lá dài và xanh. Ra rễ trên môi trường MS bổ sung 0,5 mg/l IBA; 0,1 mg/l NAA; 20 g/l sucrose 6,5 g/l agar với tỷ lệ ra rễ 100%; số rễ trung bình đạt 5,45 rễ/cây và chiều dài rễ trung bình là 3,85 cm. Cây con hoàn chỉnh được huấn luyện 2 tuần trước khi ra ngôi, sau đó trồng cây trên giá thể dớn trắng cho tỉ lệ sống 93,33%, cây khỏe, thân cứng, rễ bám tốt vào giá thể và xuất hiện lá mới sau 8 tuần. Quy trình nhân giống có thể áp dụng để sản xuất hàng loạt cây giống lan Trầm tím chất lượng tốt, đáp ứng nhu cầu nguồn cây giống hiện nay. Từ khóa: BAP, in vitro, lan Trầm tím, nhân giống, ra rễ, thể chồi. 1. ĐẶT VẤN ĐỀ Nguyễn Văn Việt (2017), nhưng các nghiên cứu Lan Trầm tím (Dendrobium nestor) thuộc về nhân giống lan Trầm tím còn rất hạn chế. chi Dendrobium là một giống lan lai tạo giữa Bài báo này, công bố kết quả nghiên cứu lan Phi điệp (Dendrobium anosmum) và lan nhân giống in vitro lan Trầm tím đạt hiệu quả Hoàng thảo tím (Dendrobium parishii) thuộc cao nhằm góp phần vào công tác bảo tồn chi Dendrobium. Lan Trầm tím có hoa rất đẹp, nguồn gen và nhân giống phục vụ thương mại chu kỳ hoa dài, hoa tươi lâu, dáng cong buông hóa loài lan có giá trị thẩm mỹ cao này. thõng mùi thơm nhẹ dễ chịu như hương trầm; II. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU có màu tím hồng rất đẹp. Trong tự nhiên nhân 2.1. Vật liệu nghiên cứu giống hoa lan chủ yếu bằng con đường sinh Vật liệu tươi: Quả lan Trầm tím chín sinh lý sản sinh dưỡng từ vật liệu thân, cành. Nhưng đến 80%, được thu hái từ vườn lan Vân Anh - nhân giống bằng hình thức sinh dưỡng thường Hoài Đức – Hà Nội. cho hệ số nhân giống thấp và ảnh hưởng lớn Môi trường dinh dưỡng: Các hóa chất pha đến cây mẹ. Mặt khác, hạt lan trong tự nhiên môi trường MS; bổ sung chất hữu cơ (Chuối rất khó nảy mầm vì hạt không chứa nội nhũ xanh và Khoai tây có hàm lượng 50 – 150 g/l). nên khả năng nhân giống hữu tính không khả Chất kích thích sinh trưởng thực vật: BAP; thi. Để giải quyết vấn đề trên, kỹ thuật nuôi Kinetin; NAA; IBA; NAA. cấy mô tế bào đã được áp dụng, bởi nhân giống Chất khử trùng: HgCl2 0,1%; cồn 960. bằng phương pháp này cho hệ số nhân cao, có Vật liệu trồng lan: xơ dừa (100%), vỏ thông thể tạo được hàng loạt cây giống có sức sinh (50%), xơ dừa (50%), dớn trắng (100%). trưởng tốt, cây giống đồng đều và không phụ 2.2. Phương pháp nghiên cứu thuộc mùa vụ. 2.2.1. Phương pháp nghiên cứu chung Hiện nay, trên thế giới và ở Việt Nam có Sử dụng quả lan làm nguồn vật liệu khởi nhiều nghiên cứu về nhân giống in vitro chi đầu, tiến hành khử trùng và cấy hạt trên môi Dendrobium đã được thực hiện như Sana trường dinh dưỡng cơ bản MS. Khi hạt nảy Asghar và cộng sự (2011); Lita Soetopo và mầm chuyển sang môi trường có bổ sung chất cộng sự (2012); Jaime A và cộng sự (2015); điều hòa sinh trưởng để nghiên cứu nhân Edy Setiti và công sự (2017), Nguyễn Văn Kết nhanh thể chồi. Khi chồi có số lá 2 – 3 lá thì (2010); Vũ Kim Dung và cộng sự (2016), chuyển sang môi trường nhân nhanh kích thích 38 TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ LÂM NGHIỆP SỐ 1 – 2019 Công nghệ sinh học & Giống cây trồng tăng trưởng chồi. Khi chồi cao 4 – 5 cm, có 3 – tây với hàm lượng 50 – 150 g/l để nghiên cứu 4 lá cấy chuyển sang môi trường kích thích tạo đến khả năng tăng trưởng chồi. Thời gian theo rễ, những cây không đủ kích thước thì tiếp tục dõi là 8 tuần đối với các chỉ tiêu về: hệ số nhân cấy chuyển sang môi trường nhân nhanh kích chồi, chiều cao chồi, chất lượng chồi. thích tăng trưởng chồi. Cây lan hoàn chỉnh Tạo cây hoàn chỉnh: Chồi đạt tiêu chuẩn khi được huấn luyện 2 tuần trước khi trồng ngoài có 4 – 5 lá, cao 3 – 4 cm được cấy chuyển trên vườn ươm trên các giá thể. môi trường ra rễ là môi trường dinh dưỡng cơ Các môi trường nuôi cấy được chỉnh pH = bản MS bổ sung 20 g/l sucrose; 6,5 g/l agar; 5,8, sau đó khử trùng ở 1180C trong thời gian 0,3 – 0,7 mg/l IBA; 0,1 mg/l NAA. Thời gian 20 phút. theo dõi là 6 tuần đối với các chỉ tiêu về số Các mẫu cấy được nuôi ở điều kiện ánh chồi ra rễ, số lượng rễ, chiều dài rễ. sáng đèn huỳnh quang 12 giờ/ngày, cường độ Trồng cây lan in vitro ngoài vườn ươm: Cây 2000 – 3000 lux, nhiệt độ 24 ± 20C. Các thí con hoàn chỉnh có chiều cao 4 – 5 cm, rễ mập, nghiệm được bố trí đồng nhất và chỉ thay đổi 5 – 6 rễ/cây huấn luyện dưới ánh sáng tán xạ yếu tố nghiên cứu. khoảng 2 tuần. Sau đó, rửa sạch rễ cây lan và Bố trí công thức thí nghiệm: 90 mẫu/công cấy vào các loại giá thể khác nhau: 100% xơ thức, 30 mẫu/lần lặp. dừa, 50% xơ dừa, 50% vỏ thông và 100% dớn 2.2.2. Phương pháp bố trí thí nghiệm trắng. Thời gian thu thập số liệu là 8 tuần với Khử trùng mẫu: Quả lan Trầm tím đã chín các chỉ tiêu theo dõi là số cây sống, chất sinh lý, không bị nứt vỏ, được rửa sạch dưới lượng cây. vòi nước, sau đó dùng khăn sạch lau khô, dùng 2.2.3. Phương pháp xử lý số liệu bông tẩm cồn 700 nhẹ nhàng lau sạch bề mặt So sánh kết quả giữa các công thức thí quả lan. Sau đó khử trùng quả bằng 2 cách: 1) nghiệm về tỉ lệ mẫu sạch, tỉ lệ mẫu tạo cụm khử trùng bằng HgCl2 0,1% với thời gian khác chồi, tỉ lệ chồi ra rễ bằng tiêu chuẩn khi bình nhau (3, 5 và 7 phút); 2) khử trùng bằng cách phương (2). So sánh giữa các công thức thí nhúng quả lan vào cồn 960 rồi đốt trên ngọn nghiệm về số lượng chồi/cụm, chiều dài chồi, lửa đèn cồn (đến khi cồn bám vào quả lan được chiều dài rễ và số lượng rễ/cây bằng phân tích cháy hết) thực hiện thao tác trên với số lần 1, phương sai một nhân tố. 2, 3 và 4 lần. Sau khi khử trùng, tách vỏ quả và Số liệu đã thu thập được xử lý bằng phần cấy hạt trên môi trường dinh dưỡng cơ bản mềm SPSS (Nguyễn Hải Tuất và Nguyễn MS bổ sung 30 g/l sucrose; 5,5 g/l agar. Chỉ Trọng Bình, 2005) và phần mềm Excel. tiêu theo dõi là tỷ lệ bình mẫu sạch (%), tỷ lệ 2.3. Địa điểm nghiên cứu bình nảy chồi (%), thu thập số liệu sau 8 tuần Thí nghiệm được tiến hành tại phòng nuôi nuôi cấy. cấy mô – tế bào thực vật của Viện Công nghệ Nhân nhanh thể chồi: Cấy chuyển thể chồi sinh học Lâm nghiệp, Trường Đại học Lâm sang môi trường dinh dưỡng cơ bản MS bổ nghiệp. sung 0,2 mg/l Kinetin; 0,2 mg/l NAA; 0,2 – 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 0,8 mg/l BAP; 30 g/l sucrose; 5,5 g/l agar. 3.1. Ảnh hưởng của các phương pháp khử Thể chồi được cấy theo cụm (20 thể trùng đến khả năng tạo mẫu sạch và nảy chồi/cụm), chỉ tiêu theo dõi là: hệ số nhân mầm nhanh thể chồi (lần); chất lượng thể chồi, thời Quả lan sau khi làm sạch được khử trùng gian theo dõi là 6 tuần. bằng HgCl2 0,1% với thời gian khác nhau và Kích thích tăng trưởng chồi: Sử dụng công khử trùng bằng nhúng cồn rồi đốt trên ngọn lửa thức môi trường bổ sung chất điều hòa sinh đền cồn với số lần khác nhau (1, 2, 3 và 4 lần). trưởng cho kết quả tốt nhất ở thí nghiệm trên, Kết quả tạo mẫu sạch lan Trầm tím được thể bổ sung rẽ hoặc kết hợp chuối xanh và khoai hiện ở bảng 1. TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ LÂM NGHIỆP SỐ 1 – 2019 39 Công nghệ sinh học & Giống cây trồng Bảng 1. Ảnh hưởng của phương pháp khử trùng đến khả năng tạo mẫu sạch và nảy chồi Đốt bằng Tổng số Bình mẫu sạch Khử trùng bằng 0 Bình mẫu sạch CTTN cồn 96 bình vào nảy mầm HgCl2 0,1% (phút) (lần) mẫu (bình) n % n % CT1 3 76 58 76,3 50 65,8 CT2 5 75 68 90,6 54 72,0 0 CT3 7 67 62 92,5 37 55,2 CT4 1 72 28 38,9 25 34,7 CT5 0 2 70 44 62,9 38 54,3 CT6 3 76 73 96,1 69 90,8 CT7 4 70 67 97,1 52 74,3 Sig 0,0001 0,0001 Kết quả ở bảng 1 cho thấy các công thức 76,7%. Do vậy, có thể thấy phương pháp dùng khử trùng quả lan Trầm tím khác nhau đã có cồn đốt quả lan cho hiệu quả rõ rệt và không ảnh hưởng rõ rệt đến khả năng tạo mẫu sạch gây độc cho người sử dụng. Kết quả thu được (Sig = 0,0001 < 0,05). Trong đó, công thức ở hình 1.a; 1.b. khử trùng quả lan bằng đốt cồn 3 lần cho hiệu 3.2. Ảnh hưởng của nồng độ chất điều hòa quả tốt nhất với 96,1% bình mẫu sạch và sinh trưởng đến khả năng nhân nhanh thể 90,8% bình mẫu sạch nảy mầm. So sánh với chồi kết quả của tác giả Nguyễn Quỳnh Trang và Thí nghiệm được tiến hành trên môi trường cộng sự (2013) và Nguyễn Văn Việt (2017) dinh dưỡng cơ bản MS bổ sung chất điều hòa cũng nghiên cứu tạo mẫu sạch từ quả lan đều sinh trưởng (BAP, Kinetin và NAA) với các sử dụng HgCl2 0,1% trong thời giam 7 – 12 nồng độ khác nhau. Kết quả được thể hiện ở phút cho tỉ lệ mẫu sạch nảy mầm là 56,6% – bảng 2. Bảng 2. Kết quả ảnh hưởng của nồng độ chất ĐHST đến khả năng nhân nhanh thể chồi Chất ĐHST (mg/l) CTTN Hệ số nhân (lần) Chất lượng thể chồi BAP Kinetin NAA ĐC 0 0 0 1,05 Thể chồi nhỏ, xanhvàng CT1 0,2 3,24 Thể chồi nhỏ, xanh tốt CT2 0,4 6,33 Thể chồi mập, xanh tốt 0,2 0,2 CT3 0,6 4,77 Thể chồi nhỏ, hơi vàng CT4 0,8 4,87 Thể chồi nhỏ, hơi vàng CT5 0,2 5,25 Thể mập, xanh tốt CT6 0,4 4,27 Thể chồi mập, xanh tốt 0,3 0,2 CT7 0,6 3,78 Thể chồi nhỏ, hơi vàng CT8 0,8 2,63 Thể chồi nhỏ, xanhvàng Số liệu bảng 2 cho thấy, chất điều hòa sinh cấy bổ sung 0,2 mg/l BAP cho hệ số nhân chồi trưởng có ảnh hưởng rõ rệt đến khả năng tạo thấp nhất chỉ đạt 3,24 lần, chồi nhỏ, hơi vàng. cụm chồi của lan Trầm tím (Sig < 0,05). Môi Tăng nồng độ BAP đến 0,4 mg/l đã làm tăng trường bổ sung chất điều hòa sinh trưởng cho hệ số nhân chồi (6,33 lần) và chồi mập, xanh hệ số nhân chồi (2,63 – 6,33 lần) vượt xa so với tốt (hình 1.c). Tiếp tục tăng nồng độ BAP cao đối chứng (chỉ 1,05 lần). Môi trường nuôi cấy hơn 0,4 mg/l thì hệ số nhân chồi giảm, chồi MS bổ sung 0,2 mg/l Kinetin; 0,2 mg/l NAA; sinh trưởng kém và chuyển màu vàng. Ở môi 0,2 – 0,8 mg/l BAP ảnh hưởng rõ rệt đến hệ số trường nuôi cấy MS bổ sung 0,3 mg/l Kinetin; nhân chồi và chất lượng chồi. Môi trường nuôi 0,2 mg/l NAA; 0,2 mg/l BAP cho hệ số nhân 40 TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ LÂM NGHIỆP SỐ 1 – 2019 Công nghệ sinh học & Giống cây trồng chồi cao nhất (đạt 5,25 lần) chồi mập và xanh 3 mg/l 2,4D và 1 – 3 mg/l BA có thể tạo 2 – 3 tốt. Tăng nồng độ BAP cao hơn 0,4 mg/l làm cụm protocorm/mẫu. Đây cũng là nghiên cứu giảm hệ số nhân chồi và chồi nhỏ, chuyển đầu tiên về ảnh hưởng của tổ hợp giữa 3 chất vàng. Như vậy, với môi trường dinh dưỡng cơ điều hòa sinh trưởng BAP, Kinetin và NAA bản MS bổ sung 0,4 mg/l BAP; 0,2 mg/l NAA; trong nhân giống cây Dendrobium nestor. 0,2 mg/l kinetin; 30 g/l đường sucrose; 6,5 g/l 3.3. Ảnh hưởng của chất hữu cơ bổ sung đến agar thích hợp cho nhân nhanh thể chồi lan khả năng tăng trưởng chồi Trầm tím. Trong nhân giống in vitro, nhiều Kích thích tăng trưởng chồi là giai đoạn có loại cây trồng chỉ phù hợp với các chất thuộc ý nghĩa hết sức quan trọng đối với việc tạo ra nhóm cytokinin, nhưng nhiều loại cây trồng cây con đủ tiêu chuẩn để trồng ngoài vườn khi kết hợp các chất điều hòa sinh trưởng giữa ươm. Khi chồi đạt 2 – 3 lá chuyển sang môi nhóm cytokinin và auxin nâng cao hiệu quả trường kích thích tăng trưởng chồi là công thức trong nhân giống. Theo nghiên cứu của môi trường tốt nhất tại bảng 2. Kết quả được Stefanello et al. (2009) nuôi cấy đỉnh rễ và lá thể hiện ở bảng 3. non, trên môi trường dinh dưỡng MS, bổ sung Bảng 3. Ảnh hưởng của hàm lượng chất bổ sung đến khả năng tăng trưởng chồi Chất hữu cơ vbổ sung (g/l) Hệ số nhân Chiều cao CTTN Chất lượng cây chồi (lần) TB/chồi (cm) Khoai tây Chuối xanh ĐC 0 0 1,78 2,23 Cây nhỏ, lá ngắn và hơi xanh CT1 50 – 2,78 3,67 Cây mập, lá ngắn và xanh CT2 100 – 4,12 4,23 Cây mập, lá dài và xanh CT3 150 – 2,57 2,88 Cây mập, lá ngắn và vàng CT4 – 70 2,64 2,55 Cây nhỏ, lá ngắn và hơi vàng CT5 – 100 2,92 2,75 Cây nhỏ, lá dài và vàng xanh CT6 – 150 2,57 2,68 Cây nhỏ, lá dài và xanh CT7 50 50 3,22 3,15 Cây mập, lá ngắn và xanh CT8 70 30 3,75 3,26 Cây mập, lá ngắn và xanh CT9 30 70 2,63 3,57 Cây mập, lá ngắn và vàng Sig 0,0001 0,0001 Kết quả bảng 3 cho thấy bổ sung riêng rẽ hệ số nhân chồi thấp và lá bị chuyển sang màu hoặc kết hợp bột khoai tây và chuối ở nồng độ vàng. Điều này có thể do các chất hữu cơ bổ khác nhau có ảnh hưởng rõ rệt hệ số nhân chồi sung ở nồng độ cao làm đặc môi trường nuôi và chiều cao chồi lan Trầm tím (Sig < 0,05). cấy ảnh hưởng đến khả năng hút chất dinh Bổ sung bột khoai tây vào môi trường nuôi cấy dưỡng của cây và làm cho cây sinh trưởng cây sinh trưởng rất tốt (với hệ số nhân chồi đạt kém. Do đó, môi trường bổ sung 100 mg/l từ 2,57 – 4,12 lần, chiều cao từ 2,88 – 4,23 cm khoai tây cho hiệu quả tốt nhất, với hệ số nhân và cây phát triển mập, sau đó đến môi trường chồi đạt 4,12 lần, chồi cao 4,23 cm, thân mập kết hợp giữa chuối và khoai tây (hệ số nhân lá dài và xanh (hình 1.d). Kết quả này cũng chồi đạt từ 2,63 – 3,75 lần, chiều cao từ 3,15 – phù hợp với nghiên cứu của Phùng Văn Phê và 3,57 cm), kém nhất là môi trường chỉ bổ sung cộng sự (2010) khi bổ sung 100 g/l bột khoai chuối xanh (hệ số nhân chồi đạt từ 2,57 – 2,92 tây vào môi trường nuôi cấy lan Kim Tuyến lần, chiều cao từ 2,55 – 2,75 cm) cây nhỏ. Nhìn (Anoectochilus roxburghii), kết quả hệ số nhân chung, khi lượng khoai tây và chuối tăng đến nhanh chồi in vitro sau 8 tuần nuôi cấy đã tăng 150 mg/l chồi đều kém phát triển về chiều cao, gấp 6,5 lần. Nghiên cứu của Vũ Quốc Luận và TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ LÂM NGHIỆP SỐ 1 – 2019 41 Công nghệ sinh học & Giống cây trồng cộng sự (2014) khi bổ sung 100 – 200 g/l khoai 3.4. Ảnh hưởng của nồng độ chất điều hòa tây vào môi trường nuôi cấy lan Vân hài cho sinh trưởng đến khả năng ra rễ cây sinh trưởng tốt cả về số lá và chiều dài lá. Chồi đạt tiêu chuẩn 4 – 5 lá, dài 3 – 4 cm Như vậy, sau 8 tuần nuôi cấy, chồi lan Trầm được cấy chuyển trên môi trường ra rễ, môi tím sinh trưởng và phát triển tốt nhất trên môi trường được sử dụng là MS bổ sung chất điều trường MS bổ sung 0,4 mg/l BAP; 0,2 mg/l hòa sinh trưởng IBA và NAA với các nồng độ NAA; 0,2 mg/l kinetin; 30 g/l sucrose; 5,5 g/l khác nhau. Kết quả thể hiện ở bảng 4. agar; 100 g/l khoai tây. Bảng 4. Ảnh hưởng của nồng độ chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng ra rễ Chất ĐHST (mg/l) Tỉ lệ ra Số rễ Chiều dài rễ CTTN Đặc điểm của rễ rễ (%) TB/cây TB/cây (cm) IBA NAA ĐC 0,0 100 2,32 2,25 Rễ ngắn, màu trắng, mập CT1 0,3 100 3,52 3,33 Rễ dài,màu xanh nhạt 0,0 CT2 0,5 100 4,15 3,25 Rễ dài, màu xanh đậm CT3 0,7 100 3,08 2,17 Rễ ngắn, màu trắng, mập CT4 0,3 100 4,15 3,12 Rễ dài, màu xanh nhạt CT5 0,5 0,1 100 5,45 3,85 Rễ dài, màu xanh đậm CT6 0,7 100 3,37 2,15 Rễ ngắn, màu trắng, mập Sig 0,0001 0,0001 Số liệu bảng 4 cho thấy khả năng ra rễ của lan Phi điệp tím với tỷ lệ chồi ra rễ đạt 98%, số lan Trầm tím rất tốt đạt 100%. Tuy nhiên, có rễ trung bình đạt trên 3 rễ/cây và nghiên cứu sự khác nhau rõ rệt về số rễ/cây và chiều dài của Nguyễn Văn Việt (2017) cho lan Hoàng rễ/cây giữa các công thức thí nghiệm (Sig < thảo kèn giai đoạn ra rễ cũng phối hợp 0,2 mg/l 0,05). Trong nhóm công thức chỉ bổ sung riêng IBA; 0,3 mg/l NAA với 100% chồi ra rễ, 4,8 rẽ IBA cho thấy ở nồng độ 0,5 mg/l cho hiệu rễ/cây và chiều dài rễ đạt 3,6 cm. Như vậy, sau quả tốt nhất (với 4,15 rễ/cây và rễ dài 3,25 8 tuần nuôi cấy, chồi lan Trầm tím ra rễ tốt cm), khi tăng hay giảm nồng độ quanh ngưỡng nhất trên môi trường MS bổ sung 0,5 mg/l IBA; 0,5 mg/l IBA đều cho kết quả kém hơn. Khi bổ 0,1 mg/l NAA; 20 g/l sucrose; 6,5 g/l agar. sung kết hợp 0,1 mg/l NAA và 0,3 – 0,7 mg/l 3.5. Ảnh hưởng của giá thể đến tỷ lệ sống và NAA hiệu quả ra rễ tốt hơn sử dụng riêng rẽ sinh trưởng của cây giai đoạn vườn ươm chỉ IBA. Trong đó, công thức bổ sung 0,5 mg/l Cây con hoàn chỉnh có chiều cao 4 – 5 cm, IBA; 0,1 mg/l NAA cho kết quả tốt nhất (với rễ mập, có 5 – 6 rễ/cây được huấn luyện dưới 5,45 rễ/cây và rễ dài 3,85 cm) (hình 1.e). ánh sáng tán xạ khoảng 1 – 2 tuần trước khi ra Theo nghiên cứu của Nguyễn Quỳnh Trang cây. Sau đó cây con được rửa sạch và cấy vào và cộng sự (2013), cũng phối hợp 0,3 mg/l các loại giá thể khác nhau. Kết quả thu được IBA; 0,1 mg/l NAA cho kết quả khá tốt đối với sau 8 tuần ra ngôi được thể hiện ở bảng 5. Bảng 5. Ảnh hưởng của giá thể đến tỷ lệ sống và sinh trưởng của cây giai đoạn vườn ươm Số mẫu cấy Tỷ lệ cây sống CTTN Loại giá thể Chất lượng cây (cây) (%) CT1 100% xơ dừa 90 76,67 Cây yếu, rễ mới bám giá thể 50% xơ dừa + Cây khỏe, thân cứng, rễ bám giá CT2 90 90,00 50% vỏ thông thể tốt Cây khỏe, thân cứng, xuất hiện lá CT3 100% dớn trắng 90 93,33 mới, rễ bám giá thể tốt 42 TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ LÂM NGHIỆP SỐ 1 – 2019 Công nghệ sinh học & Giống cây trồng Giá thể ra ngôi lan Trầm tím có ảnh hưởng việc ra ngôi cây mô lan Trầm tím. Kết quả này rõ rệt đến tỉ lệ sống và sinh trưởng của cây con cũng tương đương với kết quả Phan Xuân ở giai đoạn vườn ươm. Giá thể xơ dừa cho tỷ lệ Huyên và cộng sự (2015) sử dụng giá thể dớn cây sống thấp nhất (76,67%), cây yếu, rễ mới trắng để ra cây mô loài Miltonia sp. với 86% bám vào giá thể. Cây trồng trên giá thể trộn cây sống, 5,60 rễ/cây và chiều dài rễ đạt 2,70 cm. 50% xơ dừa; 50% vỏ thông và 100% dớn trắng So sánh với kết quả nghiên cứu của tác giả cho hiệu quả tốt hơn (tỉ lệ sống 90%). Tuy Stefanello và cộng sự (2009), Yamamoto và nhiên, trên giá thể dớn trắng cây khỏe, thân cộng sự (2009) và Yamakami và cộng sự cứng, rễ bám tốt vào giá thể và đặc biệt xuất (2009) thì kết quả nghiên cứu trên hoàn toàn hiện lá mới; tỷ lệ cây sống 93,33% (hình 1.f). vượt trội. Như vậy, có thể sử dụng công thức Như vậy, với giá thể là dớn trắng đủ mềm và thí nghiệm 3 (100% dớn trắng) là phù hợp cho đủ xốp để cây có thể giữ ẩm tốt, phù hợp trong việc trồng lan Trầm tím ngoài vườn ươm. (a) (b) (c) (d) (e) (f) Hình 1. Một số hình ảnh lan Trầm tím trong quy trình nhân giống Ghi chú: a) Hạt lan Trầm tím; b) Hạt nảy mầm; c) Nhân thể chồi; d) Tăng trưởng chồi; e) Cây hoàn chỉnh; f) Cây trồng trên giá thể dớn trắng 4. KẾT LUẬN mg/l NAA; 0,2 mg/l Kinetin; 30 g/l sucrose; Khử trùng hiệu quả đối với lan Trầm tím là 5,5 g/l agar; 100 g/l khoai tây cho hệ số nhân nhúng quả lan vào cồn 960, sau đó đốt trên chồi đạt 4,12 lần, chiều cao chồi là 4,23 cm, ngọn lửa đèn cồn, lặp lại thao tác này 3 lần cho thân mập, lá dài và xanh sau 8 tuần nuôi cấy. tỉ lệ bình mẫu sạch nảy mầm đạt 90,8% sau 8 Cảm ứng ra rễ, tạo cây hoàn chỉnh trên môi tuần nuôi cấy. trường dinh dưỡng cơ bản MS bổ sung 0,5 Nhân nhanh thể chồi bằng môi trường dinh mg/l IBA; 0,1 mg/l NAA, với 100% chổi ra rễ; dưỡng cơ bản MS bổ sung 0,4 mg/l BAP; 0,2 5,45 rễ/cây và rễ dài 3,85 cm sau 6 tuần nuôi cấy. mg/l NAA; 0,2 mg/l kinetin; 30 g/l sucrose; 5,5 Giá thể dớn thích hợp để ra ngôi cây lan g/l agar, cho hệ số nhân chồi đạt 6,33 lần sau 6 Trầm tím in vitro với tỉ lệ sống đạt 93,33%, tuần nuôi cấy. cây khỏe, thân cứng, rễ bám tốt vào giá thể và Tăng trưởng chồi trên môi trường dinh xuất hiện lá mới sau 8 tuần cho ra cây ngoài dưỡng cơ bản MS bổ sung 0,4 mg/l BAP; 0,2 vườn ươm. TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ LÂM NGHIỆP SỐ 1 – 2019 43 Công nghệ sinh học & Giống cây trồng TÀI LIỆU THAM KHẢO cell Rep, 34: 671 – 704. 1. Vũ Kim Dung, Nguyễn Văn Việt, Bùi Văn Thắng 9. Lita Soetopo and Sri Lestari Purnamaningsih (2016). Nhân giống lan Hoàng thảo ý thảo ba màu (2012). In vitro propagation of Dendropbium and (Dendrobium gratiosisimum Reichenb.f) bằng kĩ thuật Phalaenopsis through tissue culture for conservation. nuôi cấy in vitro. Tạp chí Khoa học và Công nghệ Lâm Agrivita, 34 (2): 115 – 126. nghiệp, 6: 156 – 161. 10. Sana Asghar, Touqeer Ahmad, Ishfaq Ahmad 2. Nguyễn Văn Kết, Nguyễn Văn Minh (2010). Hafiz (2011). In vitro propagation of orchid Nghiên cứu khả năng nhân giống loài lan Hoàng thảo (Dendrobium nobile) var, Emma white. African Journal sáp (Dendrobium crepidatum Lindl, & Paxt,) in vitro. of Biotechnology, 10 (16): 3097 – 3103. Tạp chí Khoa học và Công nghệ, 48 (5): 89 – 95. 11. Stefanello S., Karsten J., Müller T.S., Tomczak 3. Dương Tấn Nhựt, Vũ Quốc Luận, Trịnh Thị A.P., Bonett L.P. and Schuelter A.R. (2009). In vitro Hương, Nguyễn Phúc Huy, Đỗ Khắc Thịnh (2014). Ảnh conversion of Miltonia flavescens Lindl. Roots and leaf hưởng của các chất bổ sung hữu cơ lên quá trình sinh tip cells in protocorm like bodies and plant regeneration. trưởng và phát triển của chồi lan vân hài (paphiopedilum Ciência & Agrotecnologia, Lavras, 33(1): 53 – 59. callosum) nuôi cấy in vitro. Tạp chí Khoa học và Công 12. Sunitibala H. and Kishor R. (2009). nghệ, 52 (1): 49-62. Micropropagation of Dendrobium transparens L. from 4. Phùng Văn Phê, Nguyễn Thị Hồng Gấm, Nguyễn axenic pseudobulb segments. Ind. J. Biotechnol., 8: 448 – 4 Trung Thành (2010). Nghiên cứu kỹ thuật nhân nhanh 13. Stefanello S., Silveira E.V., Oliveira L.K., chồi in vitro loài Lan kim tuyến Anoectochilus Besson J.C.F. and Dutra G.M.N. (2009). Efficiency of roxburghii. Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự substrates on acclimatization of in vitro propagated nhiên và Công nghệ, 26: 248-253. Miltonia flavescens Lindl. Revista em Agronegoscios e 5. Nguyễn Quỳnh Trang, Vũ Thị Huệ, Khuất Thị Meio Ambiente, 2 (3): 467 – 476. Hải Ninh, Nguyễn Thị Thơ (2013). Nhân giống invitro 14. Yamakami J.K., Faria R.T. and Stenzel N.M.C. Lan Phi Điệp Tím (Dendrobium anosmum). Tạp chí (2009). Vegetative development of Brassocattleya Khoa học và Công nghệ Lâm nghiệp, 3 (1): 16- 21. pastoral “Rosa” and Miltonia regnelli Rchb.f. X 6. Nguyễn Văn Việt (2017). Ứng dụng kĩ thuật nuôi Oncidium crispum L. (Orchidaceae) in substrates cấy in vitro trong nhân giống lan Hoàng thảo kèn alternative to xaxim (tree fern fiber). Científica, 37 (1): (Dendrobium lituiflorum Lindley). Tạp chí Khoa học 32 – 38. Công nghệ Lâm nghiệp, 4: 39 – 45. 15. Yamamoto L.Y., Sorace M., Faria R.T., 7. Nguyễn Hải Tuất, Nguyễn Trọng Bình (2005). Takahashi L.S. and Schnitzer J.A. (2009). Alternative Khai thác và sử dụng SPSS để xử lý số liệu trong lâm substrates to substitute xaxim in the cultivation of the nghiệp. NXB. Nông nghiệp. primary hybrid Miltonia regnellii Rchb. f. X Oncidium 8. Jame A, Teixeira da Silva, Jean Carlos Cardoso concolor Hook. (Orchidaceae). Cieencias Agrasrias, 30 (2015). Dendrobium micropropagation a review. Plant (1): 1035 – 1042. THE RESEARCH ON IN VITRO PROPAGATION OF Dendrobium nestor Vu Thi Phan1, Khuat Thi Hai Ninh2, Nguyen Thi Tho3 1,2,3 Vietnam National University of Forestry SUMMARY Propagation of Dendrobium nestor by in vitro culture has been studied successfully. The results showed that orchid decontamination was burned 3 times 96% ethanol was rate of 90.8% after 8 weeks of culture. Murashige and Skoog (MS) medium supplemented with growth regulator Benzylaminopurine (BAP) 0.4 mg/l; α- naphthalene acetic acid (NAA) 0.2 mg/l; kinetin 0.2 mg/l; sucrose 30 g/l; agar 5.5 g/l suitable for rapid multiplication shoots with shoot multiplication of 6.33 times after 6 weeks of culture. Stimulation of shoot growth by medium of protocom growth supplemented with 100 mg/l potato gave a shoot multiplication of 4.12 times, shoot height was 4.23 cm, leafy stems were long and green. The rooting shoots rate was 100%, the average number of root was 5.45 per individual and the average length of roots was 3.85 cm when cultured in medium MS supplemented with IBA 0.5 mg/l; NAA 0.1 mg/l; sucrose 20 g/l, agar 6.5 g/l. After the plants have been trained for two week, Dendrobium nestor were planted on the sphagnum moss immersed got the rate of living was 93.33%, healthy plants, stems, roots of the plant and new leaves after 8 weeks. This procedure can be applied for mass procuction of Dendrobium nestor to the commercial demand. Keywords: Benzyl aminopurine, Dendrobium nestor, in vitro, propagation, rootting. Ngày nhận bài : 14/8/2018 Ngày phản biện : 12/11/2018 Ngày quyết định đăng : 10/12/2018 44 TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ LÂM NGHIỆP SỐ 1 – 2019

Nghiên Cứu Kỹ Thuật Nhân Nhanh Chồi In Vitro Loài Lan Kim Tuyến Anoectochilus Roxburghii (Wall.) Lindl.

References

[1] L.V. Averyanov., The Orchids of Vietnam Illustrated Survey, Part 1 Subfamilies Apostasioideae and Spiranthoideae, Turczaninowia, 11(1) : 95-97, 2008. [2] Nguyễn Tiến Bân (chủ biên), Danh lục các loài thực vật Việt Nam, Tập 3, Nxb. Nông nghiệp, Hà Nội, 2005. [3] Bộ Khoa học và Công nghệ, Sách Đỏ Việt Nam (phần thực vật), Nxb. Khoa học Tự nhiên & Công nghệ, Hà Nội, 2007. [4] Chính Phủ Nước Cộng hòa xã hội chủ nghĩa Việt Nam, Nghị định số 32/2006/NĐ-CP, 2006. [5] Nguyễn Thị Hồng Gấm, Nghiên cứu kỹ thuật nhân giống Lan Ngọc Điểm Tai Trâu (Rhynchostylis gigantea) bằng phương pháp nuôi cấy trong ống nghiệm, Báo cáo khoa học Trường Đại học Lâm nghiệp, 2007. [6] Phạm Hoàng Hộ, Cây cỏ Việt Nam, Quyển 3, Nxb. Trẻ, Tp. Hồ Chí Minh, 2000. [7] Phùng Văn Phê và nnk, Nghiên cứu kỹ thuật nhân giống In vitro loài Lan kim tuyến Anoectochilus setaceus Blume, Báo cáo khoa học Trường Đại học Lâm nghiệp, 2009. [8] Nguyễn Đức Thành, Nuôi cấy mô – tế bào thực vật – Nghiên cứu ứng dụng, Nhà xuất bản Nông nghiệp, Hà Nội, 2000. [9] Bùi Thị Tường Thu và nnk, Nghiên cứu ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng đến quá trình nuôi cấy phát sinh tế bào soma và phôi vô tính ở cây hoa Dendrobium, Phalaennopsis, Cymbidium, Báo cáo hội nghị khoa học toàn quốc lần thứ IV: Hóa sinh và sinh học phân tử phục vụ Nông, Sinh, Y học và Công nghiệp thực phẩm, 881-884, 2008. [10] Nguyễn Thanh Tùng, Nhân nhanh in vitro cây Mỹ Dung dạ lan (Vanda denisoniana Benson), Báo cáo Hội nghị Công nghệ sinh học toàn quốc, 452-455, 2009. Van Ket Nguyen, Effect of Environmental Conditions on In Vitro and Ex Vitro Growth of Jewel Orchid Anoectochilus formosanus Hayata, Thesis for the Degree of Doctor of Philosophy in Agriculture, The Graduate School of Chungbuk National University, 2003.

Nghiên Cứu Kỹ Thuật Nhân Nhanh Chồi Invitro Loài Lan Kim Tuyến Anoectochilus

Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên và Công nghệ 26 (2010) 248-253 248 Nghiên cứu kỹ thuật nhân nhanh chồi In Vitro loài Lan kim tuyến Anoectochilus roxburghii (Wall.) Lindl. Phùng Văn Phê1, Nguyễn Thị Hồng Gấm1, Nguyễn Trung Thành2,* 1Khoa Lâm học, Trường Đại học Lâm nghiệp, Xuân Mai, Chương Mỹ, Hà Nội 2Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN, 334 Nguyễn Trãi, Hà Nội, Việt Nam Nhận ngày 15 tháng 11 năm 2010 Tóm tắt. Bài báo trình bày kết quả nghiên cứu nhân nhanh chồi in vitro loài Lan kim tuyến – Anoectochilus roxburghii (Wall.) Lindl. Môi trường phù hợp nhất để nhân nhanh chồi Lan kim tuyến in vitro là Knud*. Thể chồi 8 tuần tuổi từ phôi hạt chín và chồi từ thể chồi cao từ 2-3 cm là phù hợp nhất để nhân nhanh trong môi trường thích hợp Knud* bổ sung 0,5 mg/l BAP + 0,3 mg/l Kinetin + 0,3 mg/l NAA + 100 ml/l ND + 100 g/l dịch chiết khoai tây + 20 g/l sucrose + 7 g/l agar

Từ khóa: Chồi, Lan kim tuyến, in vitro, nhân nhanh. 1. Đặt vấn đề∗

chồi/thể chồi In vitro loài Lan kim tuyến trong các điều kiện khác nhau về độ tuổi thể chồi, nguồn gốc chồi, chiều cao chồi và môi trường P.V. Phê và nnk. / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên và Công nghệ 26 (2010) 248-253 249 nuôi cấy. Môi trường nuôi cấy được sử dụng cho các thí nghiệm này bao gồm MS, Knudson, Knud* và Hyponex được bổ sung một số chất điều hòa sinh trưởng và phụ gia khác. Thí nghiệm được bố trí theo khối ngẫu nhiên đầy đủ (RCB), lặp lại 3 lần. Khi nghiên cứu ảnh hưởng của một yếu tố nào đó thì khống chế các yếu tố khác là đồng nhất. Dung lượng mẫu quan sát là 30 cho mỗi công thức thí nghiệm. – Thu thập số liệu: xác định số bình thể chồi tạo được sau mỗi lần cấy chuyển, số chồi tạo thành, đặc điểm của chồi/thể chồi (chiều cao chồi, số lá/chồi, màu sắc, độ mập, chiều dài, v.v.) – Xử lý số liệu: xác định hệ số nhân nhanh thể chồi, hệ số nhân nhanh chồi, chiều dài chồi tăng thêm theo các phương pháp thống kê sinh học, phân tích phương sai một, hai nhân tố. 3. Kết quả nghiên cứu 3.1. Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy và tuổi thể chồi đến khả năng nhân nhanh thể chồi – Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến khả năng nhân nhanh thể chồi: Thể chồi 8 tuần tuổi được chọn để cấy vào các môi trường nuôi cấy là Knudson, Knud* và Hyponex bổ sung thêm: 0,5 mg/l BAP + 0,3 mg/l Kinetin + 0,3 mg/l NAA + 100 ml/l ND + 100 g/l dịch chiết khoai tây + 20 g/l sucrose + 7 g/l agar. Kết quả thu được sau 4 tuần được thể hiện qua Bảng 1. Bảng 1. Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến khả năng nhân nhanh thể chồi Môi trường Hệ số nhân nhanh thể chồi (lần) Đặc điểm thể chồi Knudson 3,33 Thể chồi khá mập, xanh nhạt, xuất hiện ít lông tơ ở gốc thể chồi Knud* 5,33 Thể chồi mập, xanh, xuất hiện một số lông tơ từ gốc thể chồi Hyponex 2 Thể chồi bé, xanh nhạt, không xuất hiện lông tơ ở thân

Kết quả ở Bảng 1 cho thấy môi trường Knud* cho hệ số nhân nhanh thể chồi cao nhất là 5,33 lần, cao hơn nhiều so với hai công thức còn lại lần lượt là 3,33 lần đối với môi trường Knudson và 2 lần đối với Hyponex; chất lượng thể chồi ở môi trường Knud* cũng thể hiện rõ sự vượt trội so với các công thức môi trường còn lại. Như vậy, công thức môi trường Knud* là thích hợp nhất để nhân nhanh thể chồi của lan Kim tuyến. – Ảnh hưởng của tuổi thể chồi: Thể chồi từ phôi hạt chín được dùng làm vật liệu nghiên cứu cho thí nghiệm này. Tuổi thể chồi được tính từ lúc bắt đầu gieo phôi vào môi trường nuôi cấy. Thể chồi ở 6 tuần tuổi, 8 tuần tuổi và 10 tuần tuổi được cấy vào môi trường nhân nhanh thể chồi Knud* cùng bổ sung 0,5 mg/l BAP + 0,3 mg/l Kinetin + 0,3 mg/l NAA + 100 ml/l ND + 100 g/l dịch chiết khoai tây + 20 g/l sucrose + 7 g/l agar. Kết quả thu được sau 04 tuần được thể hiện trong Bảng 2.

Bảng 2. Ảnh hưởng của tuổi thể chồi đến khả năng nhân nhanh Tuổi thể chồi Đặc điểm thể chồi Hệ số nhân thể chồi (lần) 6 tuần Thể chồi khá nhiều, nhỏ, trắng hơi xanh 4,06 8 tuần Thể chồi nhiều, mập, khá xanh, xuất hiện một số lông tơ mọc từ gốc thể chồi 5,33 10 tuần Thể chồi nhiều, mập, có lông tơ xuất hiện. Xanh đậm hơn thể chồi 8 tuần tuổi. 3,17 P.V. Phê và nnk. / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên và Công nghệ 26 (2010) 248-253

250 Kết quả ở Bảng 2 chỉ rõ thể chồi 8 tuần tuổi là thích hợp nhất để nhân nhanh, với hệ số nhân cao nhất là 5,33 lần; tiếp đến là thể chồi 6 tuần tuổi, với hệ số nhân là 4,06 lần; cuối cùng là thể chồi 10 tuần tuổi với hệ số nhân thấp nhất là 3,17 lần.

Hình 1. Thể chồi Lan kim tuyến 8 tuần tuổi. Như vậy với Lan kim tuyến Anoectochilus roxburghii thì tuổi thể chồi thích hợp nhất cho nhân nhanh là 8 tuần, cho hệ số nhân nhanh cao đồng thời thể chồi tạo ra có chất lượng tốt. 3.2. Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến khả năng nhân nhanh và kích thích tăng trưởng chồi – Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến khả năng nhân nhanh chồi: Chồi từ thể chồi được chọn để cấy vào các môi trường nuôi cấy là MS, Knudson và Knud* cùng bổ sung 0,5 mg/l BAP + 0,3 mg/l Kinetin + 0,3 mg/l NAA + 100 ml/l ND + 100 g/l dịch chiết khoai tây + 20 g/l sucrose + 7 g/l agar. Kết quả nghiên cứu sau 4 tuần được thể hiện qua Bảng 3.

Bảng 3. Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến khả năng nhân nhanh chồi Môi trường Hệ số nhân nhanh chồi (lần) Số đốt thân trung bình Đặc điểm của chồi MS 2,33 3 Chồi khá mập, lá xanh nhạt, đốt thân ngắn Knud* 3 3 Chồi mập, lá xanh đậm, đốt thân ngắn Knudson 1,73 2 Chồi mảnh, lá xanh nhạt, đốt thân ngắn

Sau 4 tuần nuôi cấy số đốt thân của chồi hầu như không đổi, các chồi cao lên không đáng kể, các chồi nhân nhanh theo hướng tạo đa chồi là chính. Trong ba công thức môi trường nghiên cứu, môi trường Knud* cho hệ số nhân cao nhất là 3 lần và chất lượng chồi là tốt nhất. Chồi mập, lá xanh đậm, đốt thân ngắn. – Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến khả năng kích thích tăng trưởng chồi: chồi từ thể chồi, có chiều cao 2-3 cm, có 2-3 đốt thân và 1-2 lá hoàn chỉnh, được chọn để cấy vào các môi trường nuôi cấy là MS, Knudson và Knud* cùng bổ sung 0,3 mg/l BAP + 0,1 mg/l Kinetin + 0,1 mg/l NAA + 100 ml/l ND + 100 g/l dịch chiết khoai tây + 20 g/l sucrose + 7 g/l agar để kích thích tăng trưởng chồi. Kết quả nghiên cứu sau 4 tuần được thể hiện qua Bảng 4.

P.V. Phê và nnk. / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên và Công nghệ 26 (2010) 248-253 251 Bảng 4. Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến khả kích thích tăng trưởng chồi Môi trường Chiều cao chồi ban đầu (cm) Chiều cao chồi tăng thêm (cm) Đặc điểm chồi MS 2,28 1,23 Chồi mập, lá xanh đậm, đốt thân dài Knud* 2,27 1,23 Chồi mập, lá xanh đậm, đốt thân dài Knudson 2,31 0,87 Chồi mảnh, lá xanh nhạt, đốt thân ngắn

Kết quả nghiên cứu ở Bảng 4 cho thấy môi trường MS và Knud* cho hiệu quả tương đương nhau, chiều dài chồi tăng thêm được 1,23 cm, thể chồi mập, lá xanh đậm và đốt thân dài. Tuy nhiên, trong cả 2 nội dung nghiên cứu về nhân nhanh chồi thì môi trường Knud* cho hiệu quả tốt hơn môi trường MS. Vậy môi trường Knud*

được chọn là môi trường tốt nhất cho nhân nhanh và kích thích tăng trưởng thể chồi và chồi Lan Kim tuyến. 3.3. Ảnh hưởng của loại chồi và chiều cao đến khả năng nhân nhanh – Nhân nhanh chồi theo hướng tạo đa chồi: Các chồi có nguồn gốc, chiều cao khác nhau cùng được nuôi cấy trên môi trường Knud* bổ sung 0,5 mg/l BAP + 0,3 mg/l Kinetin + 0,3 mg/l NAA + 100 ml/l ND + 100 g/l dịch chiết khoai tây + 20 g/l sucrose + 7 g/l agar + 0,5 g/l AC. Kết quả thu được sau 04 tuần nuôi cấy được trình bày ở bảng 05. Kết quả ở Bảng 5 đã chỉ rõ, chồi từ thể chồi có chiều cao từ 2-3 cm là phù hợp nhất trong nhân nhanh theo hướng tạo đa chồi, với hệ số nhân chồi cao nhất là 5,17 lần.Bảng 5. Ảnh hưởng của chiều cao chồi đến khả năng nhân nhanh theo hướng tạo đa chồi Loại chồi Công thức thí nghiệm Chiều cao chồi (cm) Hệ số nhân chồi (lần) Đặc điểm chồi mới phát sinh I 1 – 2 1,20 Chồi có 1 – 2 đốt dài II 2 – 3 2,00 Chồi có 1 – 2 đốt dài Chồi ngọn III 3 – 4 2,00 Chồi có 1 – 2 đốt dài IV 1 – 2 3,00 Chồi có 1 – 2 đốt ngắn V 2 – 3 4,00 Chồi có 1 – 2 đốt ngắn Chồi nách VI 3 – 4 4,00 Chồi có 1 – 2 đốt ngắn VII 1 – 2 3,30 Chồi có 1 – 2 đốt ngắn VIII 2 – 3 5,17 Chồi có 1 – 2 đốt ngắn Chồi từ thể chồi IX 3 – 4 4,53 Chồi có 1 – 2 đốt ngắn

– Nhân nhanh chồi theo hướng tạo nhiều đốt: Lan kim tuyến là cây cỏ, thân chia nhiều đốt, tại các đốt có khả năng tái sinh để hình thành chồi mới. Vì vậy, ngoài việc nghiên cứu nhân chồi theo hướng tạo đa chồi, chúng tôi còn thực hiện nhân chồi theo hướng kéo dài làm tăng số đốt, từ đó cắt đốt để tạo hệ số nhân. Các chồi có nguồn gốc và chiều cao khác nhau cùng được nuôi cấy trên môi trường Knud* bổ sung 0,5 mg/l BAP + 0,3 mg/l Kinetin + 0,3 mg/l NAA + 100 ml/l ND + 100 g/l dịch chiết khoai tây + 20 g/l sucrose + 7 g/l agar + 0,5 g/l AC. Kết quả nghiên cứu thu được sau 4 tuần nuôi cấy trình bày ở Bảng 6.

P.V. Phê và nnk. / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên và Công nghệ 26 (2010) 248-253

252 Bảng 6. Ảnh hưởng của chiều cao chồi đến khả năng nhân nhanh theo hướng tạo nhiều đốt Loại chồi Công thức thí nghiệm Chiều cao chồi (cm) Hệ số nhân chồi (lần) Đặc điểm chồi mới phát sinh I 1 – 2 2,30 Chồi có 1 – 2 đốt dài II 2 – 3 2,67 Chồi có 2 -3 đốt dài Chồi ngọn III 3 – 4 2,43 Chồi có 2 -3 đốt dài IV 1 – 2 1,13 Chồi có 1 đốt ngắn V 2 – 3 1,40 Chồi có 1 – 2 đốt ngắn Chồi nách VI 3 – 4 1,27 Chồi có 3 – 4 đốt ngắn VII 1 – 2 2,67 Chồi có 2- 3 đốt ngắn VIII 2 – 3 3,37 Chồi có 3- 4 đốt dài Chồi từ thể chồi IX 3 – 4 3,27 Chồi có 3- 4 đốt dài

Kết quả nghiên cứu khẳng định trong nhân nhanh chồi theo hướng tạo nhiều đốt thì chồi từ thể chồi, có chiều cao từ 2-3 cm là phù hợp nhất, hệ số nhân chồi cao nhất là 3,37 lần. Vậy chồi từ thể chồi, có chiều cao 2-3 cm là phù hợp nhất để nhân nhanh cả theo hướng tạo đa chồi cũng như tạo nhiều đốt.

Hình 2. Cụm chồi Lan Kim Tuyến sau 6 tuần nhân nhanh trên môi trường Knud*.

Hình 3. Bình chồi Lan kim tuyến trên môi trường nhân nhanh chồi Knud*. Lời cảm ơn Các tác giả xin trân trọng cảm ơn Bộ Nông nghiệp & Phát triển Nông thôn, Trường Đại học Lâm nghiệp đã hỗ trợ kinh phí để thực hiện nghiên cứu này.

Bạn đang đọc nội dung bài viết Nghiên Cứu Nhân Giống In Vitro Lan Hoàng Thảo Phi Điệp Tím (Dendrobium Anosmum trên website Vitagrowthheight.com. Hy vọng một phần nào đó những thông tin mà chúng tôi đã cung cấp là rất hữu ích với bạn. Nếu nội dung bài viết hay, ý nghĩa bạn hãy chia sẻ với bạn bè của mình và luôn theo dõi, ủng hộ chúng tôi để cập nhật những thông tin mới nhất. Chúc bạn một ngày tốt lành!