Đề Xuất 2/2023 # Loài Lan Grammatophyllum Blume # Top 6 Like | Vitagrowthheight.com

Đề Xuất 2/2023 # Loài Lan Grammatophyllum Blume # Top 6 Like

Cập nhật nội dung chi tiết về Loài Lan Grammatophyllum Blume mới nhất trên website Vitagrowthheight.com. Hy vọng thông tin trong bài viết sẽ đáp ứng được nhu cầu ngoài mong đợi của bạn, chúng tôi sẽ làm việc thường xuyên để cập nhật nội dung mới nhằm giúp bạn nhận được thông tin nhanh chóng và chính xác nhất.

Grammatophyllum là một loài lan do Carl Blume tường trình vào năm 1825. Loài lan này mọc tại Đông Nam Á Châu và các quần đảo như Phi Luật Tân, Nam Dương cho tới Tân Tây lan.

Loài lan Grammatophyllum Blume

Gram. multiflorum Trong sách Cây Cỏ Việt Nam của giáo sư Phạm Hoàng Hộ và Phong lan của Trần Hợp đều nói tới cây Grammaphyllum speciosum có tên Việt là Thanh Tuyền, (không biết do ai đặt ra) và ghi cây này mọc tại Nam Bộ, nhưng không rõ địa danh. Gần đây nhiều người trong nước lại gọi Grammatophyllum là lan Hoàng Hậu và cũng có nhiều người đã gọi lan Cattleya với tên như vậy.

Theo tiếng La tinh Grammatophyllum (viết tắt là Gram) gramma có nghĩa là chữ và phyllum là lá, ngụ ý nói đến những vệt đậm trên hoa? Nhưng cũng có nguồn nói rằng Gramma là cỏ và phyllum là lá. Lan thường mọc trên các cành cây hay trong hốc cây hoặc giữa các nhánh trên thân cây mọc ở các vùng rừng rậm ẩm ướt. Loài lan này gồm 11 giống (có nguồn nói là 30 giống) chia ra làm hai nhóm, nhóm có củ như củ Cymbidium và nhóm có thân như thân cây mía.

Nhóm có củ: • Gram. elegans (Rchb. f.) củ cao 15-20 cm, có 3-4 lá. Dò hoa mọc từ gốc, mang theo 30-50 hoa mầu nâu nhạt hay sậm, to chừng 7 cm, nở vào mùa Xuân. • Gram. multiflorum (Lindl.) 1838, đặc hữu của Phi Luật Tân, củ cao 15 cm có 4 lá với cành hoa dài gần tới 1.50 m có cả trăm hoa. Hoa to 5 cm, chừng 8-9 tháng mới tàn. • Gram. scriptum (Lindl) Blume 1849, củ có 5-8 lá dài tới cả thước. Dò hoa mọc từ đáy củ có thể có tới gần 100 hoa to chừng 4-5 cm có những sọc hay vằn loang lổ mầu nâu.

Gram. elegans Gram. Scriptum • Gram. scriptum var. citrinum thân lá như giống Gram. scriptum nhưng hoa toàn một mầu xanh lá cây nhạt. Nhóm thứ hai, có thân như cây mía cao lớn như: Gram. speciosum, Gram. papuanum và Gram. wallisii có nhiều chuyên gia coi 2 cây kể trên như là một biệt dạng của Gram. speciosum.

• Gram. speciosum(Blume) 1825, có tên là lan hổ (Tiger Orchid) hay lan mía (Sugar cane Orchid) thân cao trên 2 thước, lá như lá mía mọc từng cụm to lớn có khi nặng tới 2 tấn. Dò hoa mọc từ ngọn dài tới trên 1 m, hoa to từ 15-20 cm mầu xanh vàng có đốm nâu đỏ. Cây phải cao trên 1 th và có nhiều thân già mới có thể ra hoa, nhưng 2-3 năm mới ra hoa một lần.

Gram. scriptum var citrinum”Hihimanu” Gram. speciosum Gram. Scriptum • Gram. papuanum (J. J. Sm) thân cây nhỏ hơn, dò hoa ngắn hơn và có khoảng 50 hoa mầu sắc vàng nhạt và có những đốm nhỏ hơn. • Gram.wallisii (Rchb. f.) hoa mầu kem hồng với đốm nâu đậm, cuống hoa mầu đỏ nhạt. Gram. papuanum Gram. wallisii Những giống Grammatophyllum khác được ghi nhận như sau:

• Grammatophyllum kinabaluense(N. Borneo). • Grammatophyllum martae(Philippines) • Grammatophyllum measuresianum(Philippines). • Grammatophyllum rumphianum(Borneo, Maluku). • Grammatophyllum schmidtianum(Marianas). • Grammatophyllum stapeliiflorum(Malaysia to New Guinea).

Grammatophyllum có thể chịu nóng tới trên 100°F (38°C) và mùa đông lạnh tới 50°F (10°C) Lan có thể trồng ở ngoài nắng, nhưng tốt hơn là phải có lưới che, nhất là những giống có củ như Gram. scriptum var citrinum cần ít nắng hơn.

Tưới nước cho lan là một vấn đề phải thận trọng. Lan cần tưới nhiều nước vào mùa hè, không được để quá khô và tưới rất thưa và ít vào mùa đông. Khi cây đang mọc bón mỗi tuần một lần với 30-10-10 và đổi sang 10-30-20 khi cây đã hết tăng trưởng mỗi tháng một lần hay bón với phân 20-20-20 quanh năm với liều lượng ¼ thìa cà phê cho 4 lít nước. Ngưng bón vào mùa đông.

Nên nhớ rễ lan Grammatophyllum rất nhậy cảm với muối đọng trong chậu cho nên cần phải tưới thật đẫm mổi tháng 1 lần. Nếu dùng phân hữu cơ như nước cá, nước phân bò v.v… pha loãng có thể tránh được điều đó.

Lan không ưa bị thay chậu ngoại trừ trường hợp vật liệu đã quá mục nát, cho nên hãy trồng với vỏ thông hay than củi, vỏ cây dương xỉ cỡ lớn, đá xanh hay đá núi lửa.

Để lan vào chỗ thoáng đãng, có không khí chuyển động và ẩm độ cao.

Nghiên Cứu Nhân Nhanh In Vitro Loài Lan Kim Tuyến (Anoectochilus Setaceus Blume) Nhằm Bảo Tồn Nguồn Dược Liệu Quý

Đặt vấn đề

Từ xưa đến nay, lan vẫn được biết đến như một loài hoa quý phái, hoa của bậc vua chúa vương giả. Lan được phát hiện đầu tiên vào những năm 40 của thế kỷ VIII, cho đến nay đã có hơn 15.000 loại lan trồng khác nhau trên trên thế giới.

Tại Việt Nam, hoa lan cũng vô cùng đa dạng phong phú, có khoảng hơn 1.000 loài hoa các loại, chúng sinh sản tại các vùng rừng, núi như Cao Bằng, Lào Cai, Huế, Quy Nhơn, Đà Lạt, Pleiku, … lan Việt Nam đẹp thanh cao lại chứa đựng nhiều ý nghĩa, có rất nhiều cây quý hiếm và có những cây trước kia chỉ thấy mọc ở Việt Nam (như lan nữ hài Paphiopedilum delenati). Họ lan (Orchidaceae) là một trong số những họ thực vật đa dạng nhất của Việt Nam, với tổng số khoảng 865 loài thuộc 154 chi. Thông thường lan được sử dụng làm cảnh. Ngoài ra, có nhiều loài lan còn được sử dụng làm thuốc.

Chi lan Kim tuyến Anoectochilus ở Việt Nam hiện thống kê được 12 loài, trong đó có loài lan Kim tuyến Anoectochilus setaceus Blume, tên khác Anoectochilus roxburghii Wall. ex Lindl. phân bố rộng ở hầu hết các tỉnh trong cả nước, được biết đến nhiều không những bởi giá trị làm cảnh, mà bởi giá trị làm thuốc của nó. Do bị thu hái nhiều để bán làm thuốc từ rất lâu, nên loài lan Kim tuyến đang bị đe dọa nghiêm trọng, rất có thể sẽ bị tuyệt chủng ngoài tự nhiên nếu chúng ta không có biện pháp bảo tồn hữu hiệu. Hiện nay, lan Kim tuyến được cấp báo trong Nghị định 32/2006/NĐ-CP thuộc nhóm IA, nghiêm cấm khai thác sử dụng vì mục đích thương mại và nhóm thực vật rừng đang nguy cấp EN A1a,c,d, trong sách đỏ Việt Nam 2007. Vì vậy, nghiên cứu kỹ thuật nhân giống loài lan Kim tuyến – Anoectochilus setaceus Blume được triển khai sẽ cung cấp những cơ sở khoa học và thực tiễn để tạo ra hàng loạt những cây con ổn định về mặt di truyền nhằm bảo tồn và phát triển loài dược liệu nguy cấp, quí hiếm này.

Xuất phát từ những cơ sở đó, chúng tôi đã lựa chọn và thực hiện nghiên cứu đề tài:”Nghiên cứu nhân nhanh in vitro loài lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume) nhằm bảo tồn nguồn dược liệu quý”.

I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Giới thiệu chung về cây Lan Kim tuyến

Chi lan Kim tuyến (Anoectochilus) còn được gọi là lan trang sức vì vẻ đẹp hấp dẫn của nó, được Carlvon Blume mô tả đầu tiên năm 1810 thuộc phân họ Orchidoideae. Trên thế giới đã thống kê được 51 loài. Ở Việt Nam hiện thống kê được 12 loài, trong đó loài lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume) được biết đến chủ yếu với công dụng làm thuốc.

Lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume) Đồng danh là (Anoectochilus roxburghi Wall.) Họ: Phong lan (Orchidaceae) Bộ: Phong lan (Orchidales)

Đây là loài đơn thân, mọc ở đất, có thân rễ mọc dài; thân trên đất mọng nước và có nhiều lông mềm, mang 2 – 4 lá mọc xoè sát đất. Lá hình trứng, gần tròn ở gốc, chóp hơi nhọn và có mũi ngắn, cỡ 3 – 4 x 2 – 3 cm, mặt trên màu nâu thẫm có vệt vàng ở giữa và màu hồng nhạt trên các gân, mặt dưới màu nâu nhạt. Cuống lá dài 2 – 3 cm. Cụm hoa dài 10 – 15 cm, mang 4 – 10 hoa mọc thưa. Lá bắc hình trứng, dài 8-10 mm, màu hồng. Hoa thường màu trắng, dài 2,5 – 3 cm; môi dài đến 1,5 cm, ở mỗi bên gốc mang 6 – 8 dải hẹp, chẻ đôi thành 2 thuỳ hình thuôn tròn. Bầu dài 13mm, có lông thưa.

Mùa hoa tháng 2, tháng 4. Tái sinh bằng chồi từ thân rễ và hạt ít, sinh trưởng rất chậm. Là loại cây ưa bóng, kỵ ánh sáng trực tiếp thường mọc dưới tán rừng nguyên sinh, rừng rậm nhiệt đới ở độ cao 500 – 1600m. Mọc rải rác vài ba cây trên đất ẩm, giàu mùn và lá cây rụng.

Phân bố: Việt Nam: Lào Cai (Sapa), Hà Giang (Quản Bạ), Yên Bái, Vĩnh Phúc (Tam Đảo), Hà Tây (Mỹ Đức: Chùa Hương), Quảng Trị (Đồng Chè), Kontum (Đắc Tô: Đắc Uy), Gia Lai (Kbang: Kon Hà Nừng)….Thế giới: Trung Quốc (Vân Nam, Quảng Đông), Ấn Độ, Lào, Inđônêxia,…

Tác dụng dược lý: Lan Kim tuyến là loài cây thuốc rất đặc biệt có tác dụng tăng cường sức khoẻ, làm khí huyết lưu thông, có tính kháng khuẩn, chữa các bệnh viêm khí quản, viêm gan mãn tính, chữa suy nhược thần kinh. Loài lan này được dùng làm thuốc chữa bệnh trị lao phổi, phong thấp, đau nhức khớp xương, viêm dạ dày mãn tính (Nguyễn Tiến Bân, Dương Đức Huyến). Trước đó, lan Kim tuyến (A. setaceus) là một trong những dược thảo quý giá, giúp bổ máu, dưỡng âm, chữa trị nóng phổi và nóng gan (Tạ A Mộc và Trần Kiến Đào, 1958). Hơn nữa mới đây người ta đã phát hiện ra khả năng phòng và chống ung thư của loại thảo dược này.

Theo các tài liệu nghiên cứu của Trung Quốc công bố gần đây bằng kỹ thuật sắc ký lỏng, sắc ký cột và kỹ thuật quang phổ đã phân lập, xác định được cấu trúc hoá học và thử hoạt tính sinh học của một số hợp chất có trong loài lan Kim tuyến (Tạp chí “Sinh học thực vật tổng hợp Trung Quốc”, tập 48 số 3, tháng 3/2006, trang 359-363). Bằng các kỹ thuật quang phổ đã xác định được 8 hợp chất hoá học. Các hợp chất này đều có hoạt tính sinh học mạnh, có khả năng làm giảm các gốc tự do trong cơ thể, nên có khả năng phòng bệnh rất tốt. Đặc biệt có hai axít hữu cơ được phân lập là Olenolic acid và Ursolic acid có khả năng chống ung thư, giảm cholesterol máu, chống tăng huyết áp, kháng khuẩn…

1.1.1. Đặc điểm hình thái

Lan Kim tuyến là cây thảo, mọc ở đất, có thân rễ mọc dài; thân trên đất mọng nước, mang các lá mọc xòe sát đất.

a. Thân rễ

Lan Kim tuyến là cây thân rễ nằm ngang sát mặt đất, đôi khi hơi nghiêng, bò dài. Chiều dài thân rễ từ 5-12 cm, trung bình là 7,87 cm. Đường kính thân rễ từ 3-4 mm, trung bình là 3,17 mm. Số lóng trên thân rễ từ 3-7 lóng, trung bình là 4,03 lóng. Chiều dài của lóng từ 1-6 cm, trung bình là 1,99 cm. Thân rễ thường có màu xanh trắng, đôi khi có màu nâu đỏ, thường nhẵn, không phủ lông.

b. Thân khí sinh

Cây lan Kim tuyến có thân khí sinh thường mọc thẳng đứng trên mặt đất, ít khi mọc nghiêng. Chiều dài thân khí sinh từ 4-8 cm, trung bình 6 cm. Đường kính thân khí sinh từ 3- 5 mm, trung bình là 3,08 cm. Thân khí sinh mang nhiều lóng, các lóng có chiều dài khác nhau. Số lóng trên thân khí sinh thay đổi từ 2-4 lóng, trung bình là 2,87. Chiều dài mỗi lóng từ 1-4 cm, trung bình 2,23 cm. Thân khí sinh thường mọng nước, nhẵn, không phủ lông; thường có màu xanh trắng, đôi khi có màu hồng nhạt.

c. Rễ

Rễ lan Kim tuyến được mọc ra từ các mẫu trên thân rễ. Đôi khi rễ cũng được hình thành từ thân khí sinh. Rễ thường đâm thẳng xuống đất. Thông thường mỗi mẫu chỉ có một rễ, đôi khi có vài rễ cùng được hình thành từ một mấu trên thân rễ. Số lượng và kích thước rễ cũng rất thay đổi tuỳ theo cá thể. Số rễ trên một cây thường từ 3 – 10, trung bình là 5,4. Chiều dài của rễ thay đổi từ 0,5 – 8 cm, rễ dài nhất trung bình là 6,07cm và ngắn nhất trung bình là 1,22 cm, chiều dài trung bình của các rễ trên một cây là 3,82 cm.

d. Lá

Lá lan Kim tuyến mọc cách xoắn quanh thân, xoè trên mặt đất. Lá hình trứng, gần tròn ở gốc, đầu lá hơi nhọn và có mũi ngắn, thường dài từ 3 – 5 cm, trung bình là 4,03 cm và rộng từ 2 – 4 cm, trung bình là 3,12 cm. Lá có màu nâu đỏ ở mặt trên và phủ lông mịn như nhung. Hệ gân lá mạng lưới lông chim, thường có 5 gân gốc. Các gân này thường có màu hồng ở mặt trên và nổi rất rõ. Đôi khi gân ở giữa có màu vàng nhạt. Mặt dưới lá có màu nâu đỏ nhạt, nhẵn với 5 gân gốc nổi rõ. Các gân bên ở phía rìa lá nổi rõ, gân ở giữa lá ở mặt dưới không rõ. Cuống lá dài 0,6 – 1,2 cm, thường nhẵn và có màu trắng xanh, đôi khi hơi đỏ tía ở bẹ lá. Bẹ lá nổi rõ và nhẵn. Số lá trên một cây thay đổi từ 2 – 6, thông thường có 4 lá. Kích thước của lá cũng thay đổi, các lá trên một cây thường có kích thước khác nhau rõ rệt.

e. Hoa, quả

Hoa lan Kim tuyến dạng cụm, dài 10 – 20 cm ở ngọn thân, mang 4 – 10 hoa mọc thưa. Lá bắc hình trứng, dài 6 – 10 mm, màu hồng. Các mảnh bao hoa dài khoảng 6 mm; cánh môi màu trắng, dài đến 1,5 cm, ở mỗi bên gốc mang 6 – 8 dải hẹp, đầu chẻ đôi. Mùa hoa tháng 10 – 12. Mùa quả chín tháng 12 – 3 năm sau.

1.1.2. Đặc điểm phân bố

1.1.2.1. Phân bố theo kiểu rừng: Kết quả điều tra đã chỉ ra rằng, hiện nay lan Kim tuyến hầu hết phân bố ở kiểu rừng kín lá rộng thường xanh á nhiệt đới núi thấp, cấu trúc rừng thường có 2 tầng cây gỗ. Đôi khi có thể gặp lan Kim tuyến ở kiểu rừng kín lá rộng thường xanh mưa mùa nhiệt đới.

– Tầng ưu thế sinh thái A2: Độ tán che thường từ 85-90%, với các loài cây gỗ chủ yếu như: Chắp tay bắc bộ (ExbuckLandia tonkinensis), Chắp tay (ExbuckLandia populnea), Thích các loại (Acer spp.), Trương vân (Toona surenii), Gội nếp (Aglaia spectabilis), Trám trắng (Canarium album), Kháo thơm (Machilus odoratissima), Sồi phảng (Lithocarpus cerebrinus), Dẻ gai bắc bộ (Castanopsis tonkinensis), Trâm trắng (Syzygium chanlos), Côm tầng (Elaeocarpus griffithii), Trâm tía (Syzygium sp.), Vỏ sạn (Osmanthus spp.), Thừng mực mỡ (Wrightia laevis), Máu chó (Knema spp.), v.v. Chiều cao của tầng A2 từ 15-25 m.

– Tầng cây gỗ A3: Bao gồm các loài cây của tầng trên còn nhỏ và các loài cây của tầng dưới như: Hoa trứng gà (Magnolia coco), Trứng gà 3 gân (Lindera sp.), Phân mã tuyến nổi (Archidendron chevalieri), Phân mã (Archidendron balansae), Mắc niễng (Eberhardtia tonkinensis), Nanh chuột (Cryptocarya lenticellata), Re hương (Cinnamomum iners), Re bầu (Cinnamomum bejolghota), Mò roi (Litsea balansae), Trà hoa vàng (Camelia spp.), Xoan đào (Prunus arborea), Trọng đũa (Ardisia spp.), v.v. Chiều cao của tầng A3 từ 815m.

– Tầng cây bụi B: Gồm các loài thực vật như Mua đất (Melastoma sp.), Ớt sừng lá nhỏ (Kibatalia mycrophylla), Lấu (Psychotria rubra), Ớt rừng (Clausena sp.), Bọt ếch (Glochidion hirsutum), v.v…

– Tầng cỏ quyết: Bao gồm chủ yếu các loài Thường sơn (Dichroa febrifuga), Cao cẳng (Ophiopogon spp.), Gừng một lá (Zingiber monophyllum), Giềng tàu (Alpinia chinensis), Sẹ (Alpinia tonkinensis), Mía dò (Costus speciosus), Mía dò bắc bộ (Costus tonkinensis), Râu hùm (Tacca spp.), Cỏ lá tre (Centosteca latifolia), Rớn đen (Adiantum flabellulatum), Hèo (Calamus rhabdocladus), Lòng thuyền (Curculigo gracilis), Móc (Caryota mitis), v.v…

– Thực vật ngoại tầng: Bao gồm các loài thuộc chủ yếu các họ Mã Tiền (Loganiaceae), họ Cau (Arecaceae), họ Na (Annonaceae), họ Kim cang (Smilacaceae), họ Củ nâu (Dioscoreaceae), họ Cà phê (Rubiaceae), họ Đậu (Fabaceae), họ Vang (Caesalpiniaceae), họ Trinh nữ (Mimosaceae), họ Ráy (Araceae), họ Thiên lý (Asclepiadaceae), họ Bòng bong (Schizaeaceae). Điển hình như: Dây hoa dẻ (Desmos chinensis), Dây dất na (Desmos spp.), Dây kim cang các loại (Smilax spp.), Củ nâu (Dioscorea cirrhosa), Móc câu đằng (Uncaria sp.), Ráy leo (Pothos scandens), Dây sưa (Dalbergia candenatensis), Dây móng bò (Bauhinia sp.), Bòng bong các loại (Ligodium spp.), Dây thèm bép (Tetrastigma rupestre), v.v…

– Mật độ phân bố: Của Lan Kim tuyến ở đây là rất thấp, trung bình khoảng 20 cây/ha. Chúng phân bố rải rác ở một số điểm thuộc khu vực nghiên cứu.

1.1.2.2. Phân bố lan Kim tuyến theo trạng thái rừng và sinh cảnh

– Theo trạng thái rừng: Kết quả điều tra đã khẳng định, lan Kim tuyến phân bố tập trung chủ yếu ở trạng thái rừng IIIA2, thuộc vùng lõi của Vườn quốc gia. Độ tán che của trạng thái rừng này từ 85-90%. Đặc điểm của cây bụi và thảm tươi ở khu vực Lan Kim tuyến phân bố là thưa thớt, độ che phủ thấp thường vào khoảng từ 15-30%, với độ cao của lớp cây bụi và thảm tươi khoảng từ 0,1-0,5m tuỳ từng khu vực. Lan Kim tuyến thường ít phân bố ở những nơi cây bụi thảm tươi dày đặc. Chúng có thể nằm ngay trên lớp thảm mục của rừng đang bị phân huỷ.

– Về sinh cảnh: Lan Kim tuyến chủ yếu phân bố trên đất, chúng mọc sát ngay bề mặt đất, nơi đất giàu mùn, độ ẩm và độ xốp cao, thoáng khí; thậm chí ngay trên lớp thảm mục của rừng đang phân huỷ. Đôi khi chúng mọc trên các tảng đá ẩm, trên các đoạn thân cây gỗ mục, trong gốc cây. Có thể bắt gặp lan Kim tuyến ở trong rừng nơi ẩm ướt, ven các khe suối, dưới tán rừng cây gỗ lớn, hoặc dưới rừng trúc, rừng sặt, trên đường mòn đi lại trong rừng.

1.1.2.3. Phân bố lan Kim tuyến theo địa lý, địa hình và đai cao

– Về địa lý, địa hình: Có thể gặp chúng ở hầu hết các dạng địa hình, như chân núi, sườn núi, đỉnh núi. – Về đai cao: Lan Kim tuyến thường phân bố ở đai cao trên 735m, tập trung chủ yếu ở độ cao trên 970m, quanh núi Rùng Rình.

1.2. Nhân giống cây lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus)

1.2.1. Nhân giống bằng hạt

Nhân giống bằng hạt hay con gọi là nhân giống hữu tính, trong thiên nhiên sự thụ phấn của lan do côn trùng thực hiện, cấu trúc hoa hoàn toàn thích ứng với sự thụ phấn đó. Hoa lan là một loại hoa lưỡng tính, nhưng do cấu trúc của hoa và sự chín của các cơ quan sinh dục trong hoa không đều nên sự giao phấn nhờ sâu bọ có tính bắt buộc đối với tất cả các loài setaceus. Sự thụ phấn của hoa trong môi trường tự nhiên được côn trùng thực hiện trên cơ sở của mùi thơm, mật, màu sắc sặc sỡ và những cấu tạo của hoa là những nhân tố chính để thu hút các tác nhân thụ phấn từ khoảng cách xa.

Ở vườn nuôi trồng lan để đảm bảo kết quả của sự giao phấn cao và tạo ra các giống lai theo ý muốn, con người phải tiến hành thụ phấn nhân tạo. Sự thụ phấn có thể cùng cây, có thể khác cây. Phương pháp này có nhiều ưu điểm: Dễ làm, giá thành hạ, thu được nhiều cây khoẻ, không bị bệnh, ngoài ra do đặc điểm giao phấn chéo có thể thu được những dòng biến dị cho vật liệu chọn tạo giống. Tuy nhiên trong thực tế hạt Lan Kim tuyến rất hiếm, số lượng hạt rất nhiều nhưng tỉ lệ nảy mầm ít, hơn nữa thời gian khá lâu để cây ra hoa có chất lượng tốt.

1.2.2. Nhân giống bằng cây con

Khi rễ cây con tương đối nhiều, cây có từ 3-5 lá, cây cứng cáp có thể tách để trồng riêng. Đây là cách nhân giống đơn giản và dễ làm nhất.

1.2.3. Phương pháp giâm cây

Lấy một giả hành cắt ra làm nhiều đoạn, mỗi đoạn có nhiều mấu. Đặt các đoạn này vào một nơi ẩm; chỉ cần cát và rêu. Sau vài tuần sẽ xuất hiện những cây con có thể đem trồng vào các chậu mới.

Phương pháp này là phương pháp cổ điển, dễ làm, quen với tập quán, kinh nghiệm của người lao động, giá thành thấp. Tuy nhiên phương pháp này cũng có một số trở ngại như: chậm (tăng khoảng 2-4 cây/năm), chất lượng giống không cao, cây hoa trồng lâu bị thoái hoá, bệnh virus có nhiều khả năng lan truyền và phát triển, từ đó làm giảm phẩm chất hoa (Nguyễn Xuân Linh, 1998)[5a].

1.2.4. Nhân giống in vitro

Nhân giống in vitro là một trong 4 lĩnh vực ứng dụng chính của công nghệ tế bào thực vật và đã mang lại hiệu quả kinh tế lớn nhất (Lê Trần Bình, 1997)

Kỹ thuật nhân nhanh in vitro nhằm phục vụ các mục đích sau: Duy trì và nhân nhanh các kiểu gen quý hiếm và làm vật liệu cho công tác tạo giống. Nhân nhanh và duy trì các cá thể đầu dòng tốt để cung cấp hạt giống các loại cây trồng khác nhau như cây lương thực có củ, các loại cây rau, cây hoa, cây cảnh, cây dược liệu thuộc nhóm thân thảo.

Nhân nhanh và kinh tế các kiểu gen quý của giống cây lâm nghiệp và gốc ghép trong nghề trồng cây ăn quả, cây cảnh thuộc nhóm cây thân gỗ. Nhân nhanh ở điều kiện vô trùng và cách ly tái nhiễm kết hợp với làm sạch virus. Bảo quản các tập đoàn giống nhân vô tính và các loại cây giao phấn trong ngân hàng gen.

1.2.4.1. Cơ sở khoa học của nhân giống in vitro

Tính toàn năng của tế bào (totipotency), từ năm 1902 nhà khoa học người Đức HaberLandt đã đề xướng ra phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật để chứng minh cho tính toàn năng của tế bào thực vật. Theo ông, mỗi tế bào được lấy từ bất kỳ cơ quan sinh vật đa bào đều có khả năng tiềm tàng phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh. Khả năng này do mỗi tế bào đều chứa bộ gen mang thông tin di truyền của toàn bộ cơ thể, khi được đặt vào môi trường thích hợp tế bào này sẽ có khả năng giống như một hợp tử ban đầu.

Một đặc tính quan trọng khác, làm cơ sở cho nuôi cấy mô tế bào thực vật là khả năng biệt hóa và phản biệt hóa của tế bào. Khả năng biệt hóa là sự biến đổi của tế bào từ tế bào phôi thành toàn bộ các tế bào chức năng trong các cơ quan của cơ thể. Ngược lại, khi được đặt vào môi trường thích hợp, các tế bào chuyên hóa của cơ thể có thể trở lại trạng thái của tế bào đầu tiên sinh ra nó – tế bào phôi. Tuy nhiên, thực tế nghiên cứu đã chứng minh, khả năng phản biệt hóa của các tế bào là khác nhau, các tế bào chuyên hóa sâu như tế bào của hệ thống mạch dẫn thực vật, tế bào thần kinh động vật, khả năng biệt hóa rất khó xảy ra. Đối với thực vật, khả năng hình thành cơ quan hay cơ thể giảm dần theo chiều từ ngọn xuống gốc (Galson, 1986; Murashige, 1974). Trong tự nhiên, tất cả các loài sinh vật đều tồn tại trong mình tiềm năng sinh sản dù là vô tính hay hữu tính, như thế các loài mới có thể duy trì được kiểu gen của mình, chiến thắng trong quá trình tiến hóa. Nhưng ngay từ khi ra đời, công nghệ nuôi cấy mô đã trở thành công cụ đắc lực phục vụ mục đích nhân giống của con người. Vậy tại sao lại phải tiến hành nhân giống in vitro? Chúng ta hãy xem xét những ý nghĩa to lớn mà nó mang lại cho nhân loại.

1.2.4.2. Ý nghĩa của nhân giống in vitro Nuôi cấy mô tế bào thực vật, thực chất là một phương pháp nhân giống vô tính. Đối với nhiều loại thực vật quý hiếm, có giá trị kinh tế và ý nghĩa sinh học cao, gặp khó khăn trong vấn đề nhân giống hữu tính thì nhân giống vô tính in vitro là công cụ vô cùng hữu ích. Nhưng trên thực tế có nhiều loại thực vật nhân giống hữu tính bằng hạt có hệ số nhân cao nhưng vẫn tiến hành nhân giống vô tính in vitro là do:

Các phương pháp nhân giống hữu tính bằng hạt mặc dù cho hệ số nhân giống cao, dễ bảo quản và vận chuyển nhưng với một số cây trồng, khi nhân giống bằng hạt sẽ cho các cây con không hoàn toàn giống bố mẹ cả về hình thái và thành phần hóa học (Calson, 1964). Sự không đồng nhất này gây ra khó khăn trong việc đưa cây vào sản xuất theo dây truyền công nghiệp, vì các cây có chất lượng sản phẩm không đồng đều, làm giảm giá trị thương phẩm. Đặc biệt, đối với các cây thuốc thì việc không đồng nhất về chất lượng hay chính là hàm lượng các chất hoạt tính sẽ dẫn đến hậu quả là nguyên liệu không ổn định, không đáp ứng được nhu cầu sản xuất. Ví dụ: đối với các cây lấy tinh dầu, việc nhân giống bằng hạt dẫn tới sự phân ly không đều về hàm lượng các thành phần hoạt chất. Theo Nilov (1936), cây Lavanda khi nhân giống bằng hạt, hàm lượng tinh dầu ở cây con phân ly từ 0,5 đến 11,3 %, hàm lượng lynalylacetat từ 11 đến 78 %; cây bạc hà nhân giống hữu tính có sự phân ly rất lớn về hàm lượng và thành phần tinh dầu (Bùi Thị Hằng, Popov, 1975; Bogonina, 1969; Murray, 1960)…

Để khắc phục những nhược điểm trên, phương pháp nhân giống vô tính được áp dụng đã mang lại nhiều hiệu quả kinh tế và ý nghĩa sinh học lớn. Phương pháp nhân giống vô tính đã khắc phục được nhiều nhược điểm của nhân giống hữu tính, ưu điểm lớn nhất của nhân giống vô tính là các cây con đồng đều về mặt di truyền do duy trì được các tính trạng của cây mẹ (Petrop, 1989), nên có thể áp dụng sản xuất đại trà cho sản phẩm có chất lượng ổn định; rút ngắn thời gian từ khi trồng đến thu hoạch tạo điều kiện cho tăng vụ, tăng sản lượng đối với những cây có thời gian nảy mầm của hạt kéo dài… Mặc dù vậy, phương pháp nhân giống vô tính truyền thống (chiết, giâm, ghép) vẫn còn nhiều nhược điểm như sự lây nhiễm bệnh qua nguyên liệu thường phổ biến và phức tạp, hệ số nhân thấp: cam thảo là 5 – 7 (Shah, Dalal, 1980), bạc hà piperita là 2-3 (Foldeli, Havas, 1979), … hơn nữa, việc sử dụng chính các bộ phận làm thuốc để nhân giống rất lãng phí, tốn kém.

Để khắc phục các nhược điểm của phương pháp nhân giống vô tính truyền thống, một phương pháp nhân giống khác đã áp dụng rộng rãi trên thế giới cũng như ở Việt Nam, đó là phương pháp nhân giống in vitro, phương pháp này có nhiều ưu điểm nổi trội như:

– Hệ số nhân giống cao, từ một cây trong vòng một năm có thể tạo thành hàng triệu cây. Hệ số nhân giống ở các loại cây khác nhau nằm trong phạm vi 36 đến 1012 / năm, cao hơn bất cứ phương thức nhân giống nào. Ví dụ: từ một củ khoai tây, sau 8 tháng nhân giống người ta thu được 2000 triệu củ đồng nhất di truyền, được trồng trên một vùng rộng 40 ha, có nghĩa là tốc độ nhân giống vô tính lớn hơn 100.000 lần so với sinh sản hữu tính (Senez, 1987).

– Tính đồng nhất và ổn định di truyền cao: Các cây con được tạo ra giống hệt với cây bố mẹ ban đầu. Theo lý thuyết từ bất kỳ một cây chọn lọc ưu việt nào đều có thể tạo ra một quần thể với độ đồng đều cao, số lượng không hạn chế.

– Nâng cao chất lượng giống do tạo được các giống sạch bệnh, loại bỏ được các nguồn vi khuẩn, virus, nấm bệnh. Trong công tác nhân giống, vấn đề được quan tâm hàng đầu là số lượng và chất lượng giống. Bằng phương pháp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, người ta đã tạo được những giống cây hoàn toàn sạch virus. Limasset và Cornel (1949) đã chứng minh được rằng, số lượng virus được giảm dần ở các bộ phận gần đỉnh sinh trưởng, riêng đỉnh sinh trưởng thì hoàn toàn sạch virus (Morel and Martin, 1952). Phương pháp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng thường kết hợp với việc xử lý nhiệt độ cao để tạo ra nguyên liệu giống sạch bệnh. Bằng cách này, ở khoai tây, virus A, X và Y đã bị loại trừ còn virus M và S được giảm đi một cách đáng kể (Kassanis, 1950; Thomson, 1956-1958; Wang and Huang, 1975).

– Nhân giống in vitro có thể nhân nhanh cây không kết hạt hoặc kết hạt kém trong những điều kiện sinh thái nhất định. Như ở cây cọ dầu, phải mất 1015 năm mới cho thu hoạch, việc chọn, tạo và nhân nhanh được một giống mới rất khó khăn. Nhưng bằng phương pháp nhân nhanh in vitro, người ta có thể cung cấp được 500000 cây con giống hệt nhau trong vòng một năm (Staritsky, 1970).

1.2.4.3. Các phương thức nhân giống vô tính in vitro

Quá trình thực hiện nhân giống in vitro tạo ra các dòng vô tính, theo Shull (1912) dòng vô tính là một nhóm cá thể có kiểu gen tương tự nhau, chúng được nhân bằng sinh sản vô tính, các dòng vô tính này sẽ được tạo ra theo các phương thức sau: – Tái sinh cây trực tiếp từ đỉnh sinh trưởng, phôi, ngọn chồi, chồi nách. – Tái sinh cây gián tiếp thông qua giai đoạn hình thành mô sẹo.

* Tái sinh cây trực tiếp từ mẫu nuôi cấy là quá trình phát động những điểm tồn tại sẵn có trong mô nuôi cấy, phân chia và tái sinh thành cây. Các cây con này được phát sinh từ các đỉnh sinh trưởng có bộ nhiễm sắc thể 2n, hoàn toàn đồng nhất về mặt di truyền và duy trì được các tính trạng của cây mẹ (Hu and Xang, 1983). Tái sinh trực tiếp cũng có thể xuất phát từ những tế bào không nằm trên đỉnh sinh trưởng, đó là các đoạn thân, mảnh lá, cuống lá, mảnh hoa… Trong trường hợp này, các tế bào thường phân chia nhưng không hình thành các tế bào mô sẹo mà tạo thành các điểm sinh trưởng cao hơn ở trường hợp nói trên.

* Con đường tái sinh gián tiếp, mẫu cấy khi nuôi trong môi trường thích hợp, thường là với auxin, có thể đem lại sự gia tăng thành khối tế bào không tổ chức, đó chính là các tế bào mô sẹo. Trong nuôi cấy, sự tăng sinh này có thể được duy trì nhiều hay ít là không hạn định, chỉ cần mô sẹo được cấy chuyển sang môi trường mới theo chu kỳ. Tuy nhiên, tế bào mô sẹo khi cấy chuyển nhiều lần sẽ không ổn định về mặt di truyền. Để tránh tình trạng này nên sử dụng các loại mô sẹo vừa mới phát sinh. Nuôi cấy mô sẹo có vai trò vô cùng quan trọng trong công nghệ sinh học thực vật. Tỷ lệ auxin và cytokinin trong môi trường có thể dẫn tới sự phát triển của ngọn, rễ hay phôi soma; từ đó có thể tạo thành cây hoàn chỉnh. Nuôi cấy mô sẹo cũng có thể được sử dụng để mở đầu nuôi cấy tế bào dịch huyền phù, tạo ra hạt nhân tạo.

1.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến nuôi cấy

1.3.1. Ảnh hưởng của điều kiện khử trùng mẫu cấy

Việc khử trùng mẫu trước khi đưa vào nuôi cấy là một ấn đề cần thiết, vì mẫu cấy ở trong tự nhiên tiếp xúc với môi trường xung quanh nên mang rất nhiều vi khuẩn, nấm… Nhưng, do mức độ nhiễm của mỗi loại mẫu là khác nhau và đặc điểm của từng loại mẫu cũng khác nhau nên cần có sự thử nghiệm về khử trùng mẫu cấy nhằm thu được lượng mẫu vô trùng nhiều mà tốn ít nhiên liệu ban đầu.

Khả năng tiêu diệt nấm và khuẩn của hóa chất khử trùng phụ thuộc vào nồng độ, thời gian xử lý và mức độ xâm nhập của chúng vào các ngõ ngách trên bề mặt của mô cấy.

Thời gian khử trùng là một điều kiện quan trọng, nó phụ thuộc vào từng loại dung dịch khử trùng và đặc điểm của từng loại mẫu cấy. Với hypoclorite, người ta thường khử trùng trong thời gian 15-30 phút, HgCl2 thường có thời gian ít hơn. Thời gian quá lâu, dung dịch khử trùng xâm nhập vào mẫu có thể gây chết mẫu, thời gian quá ngắn sẽ không loại bỏ hết nấm và vi khuẩn nên mẫu dễ bị nhiễm.

Sau khi khử trùng, mẫu cây được đặt vào các môi trường nuôi cấy, từ đây giai đoạn nuôi cấy in vitro bắt đầu. Thành phần của môi trường nuôi cấy có ảnh hưởng quyết định tới nuôi cấy.

1.3. 2. Ảnh hưởng của các thành phần hóa học

Trong nuôi cấy in vitro, cả yếu tố hóa học và yếu tố vật lý của cây trong các bình nuôi đều phải được cung cấp đầy đủ. Môi trường dinh dưỡng phải cung cấp tất cả các ion khoáng cần thiết, nguồn chất hữu cơ bổ sung như amino acid và vitamin, nguồn cacbon cố định, và một thành phần cần cho sự sống cũng phải được cung cấp đó là nước. Các nhân tố vật lý như nhiệt độ, pH, môi trường khí, ánh sáng và áp lực thẩm thấu, cũng phải được duy trì trong giới hạn chấp nhận.

Hiện nay trên thế giới có rất nhiều môi trường được sử dụng như môi trường Murashige và Skoog (1962), môi trường Gamborg (1968), môi trường Knop (1974), môi trường Anderson, Went, Knudson, Lindemann…Trong đó môi trường MS được đánh giá là phù hợp rộng rãi nhất với nhiều loại cây trồng, bao gồm cả cây hai lá mầm và cây một lá mầm. Thông thường trong một môi trường nuôi cấy phải đảm bảo các thành phần hóa học sau:

Các nguyên tố khoáng

Tùy theo nồng độ sử dụng, các nguyên tố khoáng được chia vào hai nhóm là nguyên tố đa lượng và nguyên tố vi lượng.

* Nguyên tố đa lượng: Các nguyên tố này thường chiếm 0,1 % khối lượng khô của thực vật. Nitơ, phốt pho, kali, magiê, canxi, và lưu huỳnh là các muối vô cơ. Chúng có mặt trong các hợp chất quan trọng (diệp lục. protein, acid nucleic, acid amin…), tham gia vào các quá trình như điều chỉnh áp suất thẩm thấu tế bào, vận chuyển năng lượng trong hô hấp, quang hợp, thực hiện vai trò tín hiệu tế bào,…

* Nguyên tố vi lượng: Được cung cấp với lượng rất thấp cho thực vật sinh trưởng, phát triển và có nhiều vai trò khác nhau. Mangan, iốt, đồng, coban, bo, mo, sắt và kẽm là các nguyên tố vi lượng, ngoài ra niken và nhôm cũng được tìm thấy trong một số công thức. Nguyên tố vi lượng thường có mặt trong thành phần của một số coenzyme, vitamin; tham gia vào các phản ứng trao đổi điện tử, sinh tổng hợp diệp lục,…

Chất hữu cơ bổ sung

* Các vitamin là những chất hữu cơ tham gia vào cấu trúc enzyme và cofactor trong nhiều phản ứng sinh hóa (Vũ Văn Vụ, 2006). Các loại vitamin B1, B6, PP và myoinositol là cần thiết cho nuôi cấy tế bào thực vật in vitro. Tuy nhiên, vì lý do lịch sử các loại vitamin khác nhau cũng được thêm vào để nuôi cấy. * Các amino acid có vai trò quan trọng trong việc phát sinh hình thái, amino acid, aLanine, glutamic acid, glutamine và proline cũng được sử dụng nhưng trong nhiều trường hợp là không cần thiết. Nguồn cacbon

Các mô và tế bào thực vật nuôi cấy nói chung, không thể tự quang hợp hoặc quang hợp yếu do thiếu clorophin và các điều kiện khác…do đó phải bổ sung thêm cacbon. Saccharose thường được sử dụng làm nguồn cacbon do đó những đặc tính như rẻ, dễ kiếm, đồng hóa triệt để và tương đối ổn định. Ngoài ra, các loại đường khác như glucose, maltose, galactose và sorbitol cũng có thể được sử dụng và trong những trường hợp đặc biệt có thể cung cấp tốt hơn đường saccharose. Đường vừa là nguồn cacbon cung cấp cho mẫu nuôi cấy, đồng thời còn tham gia điều chỉnh áp suất thẩm thấu của môi trường. Đường đóng góp khoảng 50-70 % vào khả năng thẩm thấu của môi trường (Trigiano and Gray, 2000). Thông thường đường saccharose được sử dụng ở nồng độ 0,2-0,3 %, nhưng nồng độ này có sự thay đổi ở từng đối tượng khác nhau và mục đích nuôi cấy khác nhau, có khi xuống tới 0,2 % (tạo dòng), có khi tăng lên đến 12 % (gây cảm ứng stress nước).

Sự hình thành rễ đòi hỏi một lượng đường được cung cấp từ quang hợp hoặc ngoại sinh. Theo George (1993) hầu hết các loại thực vật khi ra rễ thích hợp với lượng đường 20-30 g/lít. Tuy nhiên, cũng có loài yêu cầu nguồn carbohydrate ngoại sinh cao hơn. Ví dụ theo Sharma (1993) cây Gentiana kurroo chỉ có thể ra rễ tốt khi bổ sung 60 g/lít saccharose trong môi trường. Thí nghiệm áp dụng phương pháp quang tự dưỡng cho thấy các cây in vitro đã phát triển tốt trên môi trường không có đường và vitamin, độ thoáng khí cao. Tỷ lệ nhiễm nấm giảm đáng kể. Cây có diện tích lá lớn hơn và sự đóng mở của lá theo quy luật tự nhiên ngay khi gặp điều kiện thay đổi của môi trường. Trong khi đó cây nuôi cấy theo điều kiện truyền thống (có đường và vitamin) có diện tích lá nhỏ, khí khổng luôn luôn ở trạng thái mở trong nhiều giờ khi chuyển từ điều kiện in vitro ra vườn ươm. Tỷ lệ sống 95-100 % sau một tháng ở vườn ươm đối với cây nuôi cấy trên môi trường không có đường, trái lại chỉ từ 70-80 % theo phương pháp truyền thống (Nguyễn Thị Quỳnh và cộng sự, 2005).

Chất điều tiết sinh trưởng

Chất điều tiết sinh trưởng thực vật là thành phần môi trường khắt khe trong việc xác định con đường phát triển của tế bào thực vật. Các chất điều tiết sinh trưởng được sử dụng thông thường là các hormome thực vật hoặc các chất tổng hợp tương tự chúng, phổ biến là auxin và cytokinin, gibberellins, abscisic acid, ethylene. Trong đó auxin và cytokinin là hai nhóm được sử dụng phổ biến nhất.

* Nhóm auxin gồm một số hợp chất có chứa nhân idol trong phân tử. Trong nuôi cấy in vitro, auxin thúc đẩy sinh trưởng của mẫu do hoạt hóa sự phân chia và giãn nở của tế bào, kích thích các quá trình tổng hợp và trao đổi chất, tham gia điều chỉnh sự phân hóa của rễ, chồi…(Bhojwani and Razdan, 1983).

Các auxin được sử dụng với nồng độ thấp từ 10-6 – 10-1 M tùy theo từng chất, mục đích và đối tượng nghiên cứu. Hàm lượng auxin thấp sẽ kích thích sự phân hóa rễ, hàm lượng cao kích thích hình thành mô sẹo.

Auxin được chia thành hai nhóm có nguồn gốc khác nhau: trong các auxin tự nhiên, quan trọng nhất là IAA. Nhưng IAA chỉ được dùng trong một số môi trường nuôi cấy do có đặc tính không ổn định với nhiệt độ và ánh sáng. Vì vậy, các amino acid kết hợp với IAA ổn định hơn được sử dụng phổ biến hơn làm giảm bớt liên kết khi sử dụng IAA. Nhóm auxin tổng hợp tương tự IAA được sử dụng rộng rãi hơn trong các môi trường nuôi cấy như 2,4-D, IBA. NAA.

* Cytokinin kích thích sự phân chia và ảnh hưởng tới sự sinh trưởng của tế bào, cảm ứng hình thành chồi phụ và loại bỏ ưu thế ngọn (Nguyễn Như Khanh, 2002). Trong nuôi cấy mô thực vật cytokinin được dùng để kích thích sự phát sinh chồi, sử dụng kết hợp với auxin kích thích phân chia tế bào. Nồng độ cytokinin cao kìm hãm sự hình thành và phát triển của rễ (Narayaswamy, 1994). Trong các cytokinin tự nhiên có hai nhóm được sử dụng trong môi trường nuôi cấy, đó là zeatin và 2iP (2-isopentyl adenine). Nhưng chúng không được dùng phổ biến vì rất đắt (đặc biệt là zeatin) và không ổn định. Các chất tổng hợp tương tự như kinetin và BAP được sử dụng phổ biến hơn. Các chất hóa học không có based purin và thay thế bằng phenylureas, cũng được sử dụng như cytokinin trong môi trường nuôi cấy tế bào thực vật.

Trong cây có sự cân bằng nội hoocmone (Vũ Văn Vụ, 2007). Do vậy, khi sử dụng các chất điều tiết sinh trưởng trong nuôi cấy cần đặc biệt lưu ý để sử dụng nồng độ thích hợp đạt hiệu quả cao. Nhiều tác giả đã tổng kết, tỷ lệ auxin/cytokinin nếu nghiêng về phía auxin sẽ kích thích hình thành rễ; nghiêng về phía cytokinin sẽ thúc đẩy hình thành chồi; ở tỷ lệ trung gian sẽ hình thành mô sẹo.

Than hoạt tính

Than hoạt tính ban đẫu được bỏ sung vào môi trường nuôi cấy để cố gắng mô phỏng điều kiện trồng trọt, sau đó nó được sử dụng rộng rãi trong nhiều môi trường nuôi cấy. Nhiều nghiên cứu cho thấy tác dụng của than hoạt tính trong môi trường nuôi cấy mô thực vật. Đó là: sự hấp thụ các chất màu, các hợp chất phenol, các sản phẩm trao đổi thứ cấp, ảnh hưởng tới pH, xúc tác bẻ gãy đường saccharose trong khử trùng (S.C. Van Winkle et al, 1995). Ngoài ra than cũng hút các chất hữu cơ như phytohormone, vitamin, sắt, kẽm, … (Nissen & Sutter, 1990).

Điều tra tác dụng của than hoạt tính, sự khử trùng, và môi trường nuôi cấy trong thủy phân đường cho thấy, sự thủy phân của đường trong môi trường nuôi cấy phụ thuộc vào cả ion H+ và sự khử trùng và thành phần than hoạt tính. Sau khử trùng, ở môi trường MS + 5 % saccharose bổ sung than hoạt tính cho tỷ lệ đường thủy phân là 70 %, tỷ lệ tương ứng ở môi trường Gamborg là 56 %, còn ở môi trường không có than hoạt tính là 20 % (Pan and Staden, 1999).

Như vậy than hoạt tính có ảnh hưởng rõ ràng tới môi trường nuôi cấy, nhiều nghiên cứu đã cho thấy tác dụng kích thích của mô in vitro như kích thích tạo củ của hoa Lili (Nhut et al, 2001), tác dụng hình thành rễ ở Pawlownia (Lê Thị Kim Đào, 2001)…

Các chất hữu cơ bổ sung

Ngoài các thành phần dinh dưỡng bắt buộc kể trên trong môi trường nuôi cấy mô tế bà thực vật in vitro, người ta còn bổ sung thêm một số thành phần hỗn hợp tự nhiên khác như nước dừa, dịch chiết nấm men, nước ép cà chua, khoai tây, chuối… Các thành phần này thường chứa nguồn dinh dưỡng và chất điều hòa sinh trưởng đa dạng như amino acid, đường, vitamin, nucleic acid, auxin, cytokinin.

Nước dừa là thành phần khá phổ biến trong nhiều môi trường nuôi cấy. Tất cả phân tích thành phần của nước dừa từ non tới già của Tulecke et al.,(1961) cho thấy trong nước dừa có: amino acid, acid hữu cơ, đường, RNA, DNA, Inositol, auxin, cytokinin,… Hàm lượng sử dụng của nước dừa từ 10-20 %.

Tác nhân làm đặc môi trường

Tùy thuộc vào loại sinh trưởng, môi trường nuôi cấy cần được sử dụng ở dạng lỏng hoặc đặc, nhiều loại môi trường nuôi cấy đòi hỏi tế bào hoặc mô thực vật phải sinh trưởng trên bề mặt, agar là tác nhân làm đặc môi trường được sử dụng phổ biến nhất. Agar được sản xuất từ tảo biển, loại tinh khiết hay agarose có thể cũng được sử dụng, nhưng có thể khác nhau về độ đặc.

1.3.3. Ảnh hưởng của các yếu tố vật lý

Các yếu tố vật lý chính là ánh sáng, nhiệt độ, độ pH, trạng thái môi trường,…

Nhiệt độ trong phòng nuôi cấy mô thường được điều chỉnh ổn định từ 220C đến 250C. Tuy nhiên tùy từng loại nuôi cấy và đối tượng nuôi cấy mà có sự điều chỉnh nhiệt độ phù hợp. Theo nhiều nghiên cứu trong nuôi cấy mô sẹo, huyền phù tế bào với mục đích sản xuất các hợp chất thứ sinh thì sự điều chỉnh nhiệt độ rất có ý nghĩa, cảm ứng cho tế bào sinh trưởng, phân chia và tiết các hợp chất thứ sinh. Nhiệt độ còn ảnh hưởng tới nuôi cấy thông qua tác đông tới cấu trúc của các chất điều hòa sinh trưởng như IAA, GA3,… pH môi trường pH của môi trường cũng là một yếu tố rất quan trọng, ảnh hưởng tới trạng thái lý hóa của các chất trong môi trường, do đó ảnh hưởng tới khả năng điện ly của các muối, sự thủy phân hóa các chất… Thông thường pH được điều chỉnh ở mức 5,5 – 5,8.

Sự phát triển của mô có thể bị thay đổi hoàn toàn nếu chúng nuôi cấy trên một môi trường đặc, lỏng hoặc nửa lỏng. Các mô nuôi cấy thường sinh trưởng tốt hơn trong môi trường lỏng, tuy nhiên môi trường lỏng cũng gây ra hiện tượng thủy tinh hóa, các mô nuôi cấy bị mọng nước gây khó khăn cho cấy chuyển và ra cây.

1.3.4. Ảnh hưởng của điều kiện ra cây

Đây là giai đoạn cuối cùng của quá trình sản xuất một cây giống in vitro. Mục đích của giai đoạn này nhằm đưa cây giống in vitro trong phòng nuôi ra ngoài tự nhiên; huấn luyện cây thích nghi với các điều kiện nhiệt độ, độ ẩm, ánh sáng tự nhiên và chuyển từ chế độ dị dưỡng sang chế độ tự dưỡng.

Mỗi loài cây có đặc điểm khác nhau, do đó để đạt tỷ lệ cây sống cao cần nghiên cứu để tìm giá thể phù hợp cho cây. Giá thể trồng cây có thể là cát, đất mùn hoặc các hỗn hợp nhân tạo không chứa đất, mùn cưa và bọt biển…

Cây nuôi cấy in vitro có đặc điểm là các khí khổng luôn mở. Vì vậy, khi chuyển cây ra vườn ươm, cây thường bị mất nước rất nhanh, do đó cần phải che phủ cẩn thận và cung cấp đủ độ ẩm cho cây bằng cách phun sương. Cần cung cấp cho cây lượng nước vừa đủ, lượng nước quá ít hoặc quá nhiều đều có ảnh hưởng không tốt cho cây.

Ngoài ra, ở giai đoạn đầu đưa ra ngoài vườn ươm, bộ rễ của cây nuôi cấy in vitro thường chưa có khả năng hấp thụ các chất ding dưỡng từ giá thể. Để tăng chất lượng của cây giống, có thể sử dụng các dung dịch dinh dưỡng để tưới cho cây.

1.4. Quy trình sản xuất cây cấy mô

Theo Debergh (1991) thì quy trình nhân giống được chia làm 5 giai đoạn: a) Lấy mẫu và xử lý mẫu Đây là giai đoạn đầu tiên trong quy trình, cần đặc biệt chú ý vì những đặc tính của mẫu cấy sẽ được duy trì và nhân lên ở tất cả các cây giống sau này. Cần chọn lọc cây mẹ ưu việt, khỏe, có giá trị kinh tế cao; trên cây mẹ tiến hành chọn cơ quan, mô để lấy mẫu, thường là chồi non, đoạn thân có chồi ngủ, hoa non, lá non… Khả năng nhiễm bệnh của mẫu phụ thuộc vào cách lấy mẫu, xử lý mẫu và điều kiện khử trùng. Mỗi loài cây có ngưỡng nhiệt độ và độ ẩm phù hợp khi bảo quản và xử lý mẫu. Với các cây cận nhiệt đới và nhiệt đới thì nhiệt độ 250C, độ ẩm 75 % là điều kiện giữ mẫu thích hợp, tỷ lệ nhiễm bệnh thấp (Deborgh and Zimmerman, 1991).

b) Tái sinh mẫu nuôi cấy

Mục đích của giai đoạn này là tái sinh các cơ quan từ mẫu nuôi cấy. Khả năng thành công của nuôi cấy mô tế bào thực vật phụ thuộc vào trạng thái tuổi của tế bào mẫu nuôi cấy, càng gần trạng thái phôi sinh thì khả năng tái sinh càng lớn. Sau một thời gian nhất định, từ mẫu nuôi cấy bắt đầu xuất hiện các cụm tế bào hoặc cơ quan (chồi, cụm chồi, rễ) hoặc các phôi vô tính có đặc tính gần như phôi hữu tính.

c) Nhân nhanh chồi

Cần tạo ra tốc độ nhân nhanh cao nhất trong điều kiện nuôi cấy, vì vậy thành phần và điều kiện môi trường phải được tối ưu nhằm đạt được mục tiêu nhân nhanh. Môi trường ở giai đoạn này cần bổ sung các hormone sinh trưởng (cytokinin, auxin), tăng thời gian chiếu sáng lên từ 16 giờ/ ngày, cường độ ánh sáng tối thiểu là 1000 lux, nhiệt độ thích hợp là từ 20 – 300C. Quy trình cấy chuyển nhân nhanh chồi thông thường diễn ra trong khoảng 1-2 tháng tùy từng loại cây. Tỷ lệ nhân nhanh sau mỗi lần cấy chuyển đạt khoảng 2 – 8 lần/ 1 lần cấy chuyển. Giai đoạn nhân nhanh chồi từ một vài chồi ban đầu không nên kéo dài quá lâu để tránh biến dị soma. Ví dụ từ một chồi cây chuối chọn lọc ban đầu người ta chỉ nên nhân lên khoảng 2000 – 3000 chồi cây sau 7 – 8 lần cấy chuyển, đối với các cây khác như mía, cúc, hoa phong Lan sau một năm có thể nhân được trên 1 triệu chồi từ một cây mẹ ban đầu.

d) Tái sinh rễ

Các chồi hình thành trong quá trình nuôi cấy có thể phát rễ tự sinh, nhưng thông thường các chồi này phải được cấy chuyển sang một môi trường khác để kích thích tạo rễ. Môi trường tái sinh rễ thường được bổ sung auxin (NAA, IBA, 2,4-D) ở liều lượng thích hợp. Tuy nhiên, một số cây như chuối thì sự hình thành rễ tốt hơn ở môi trường không có chất sinh trưởng.

e) Chuyển cây ra vườn ươm

Các cây nuôi cấy in vitro sau khi đã tái sinh hoàn chỉnh sẽ được chuyển ra ngoài vườn ươm. Cây chuyển từ trạng thái dị dưỡng sang tự dưỡng. Vì vậy, cần huấn luyện cho cây thích nghi với sự thay đổi của môi trường.

1.5. Tình hình nghiên cứu cây lan Kim tuyến

1.5.1.Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Chi lan Kim tuyến (Anoectochilus) đã được nghiên cứu chủ yếu ở Trung Quốc một cách toàn diện cả về đặc điểm hình thái, kỹ thuật nhân giống, khả năng trồng, thành phần hóa học và công dụng phòng, chữa bệnh (Lai Wan Yu, Lai Wan Nian, 2005).

Chow và CS (1982) đã nghiên cứu về nguồn vật liệu sử dụng cho nhân sinh khối in vitro loài Anoectochilus formosanus rất đa dạng. Năm 1987, Liu và CS đã chọn chồi đỉnh để nuôi cấy mô. Cũng năm 1987, Ho và CS, năm 1992, Lee và CS đã sử dụng phôi hạt để làm nguồn vật liệu nuôi cấy.

Năm 2001, các tác giả Yih-juh Shiau, Abhay Psagare, Uei-Chin Chen, Shu-Ru Yang và Hsin-Sheng Tsay đã nghiên cứu thành công loài Lan Kim tuyến (Anoectochilus formosanus Hayata) từ hạt với công thức môi trường vào mẫu là: 1/2MS + 0,2% than hoạt tính + 8% dịch chiết chuối. Môi trường được sử dụng để nhân nhanh chồi là: 1/2MS + 0,2% than hoạt tính + 8% dịch chiết chuối + 2mg/l BAP + 0,5 mg/l NAA.

Năm 2002, Tsay và CS đã cắt các mắt đốt thân lấy từ cây Anoectochilus Formosanus Hayata 2 năm tuổi cấy vào môi trường MS lỏng dung tích 500 ml + 2mg/l BAP + 0,5mg/l NAA + 2% than hoạt tính.

1.5.2. Tình hình nghiên cứu trong nước

Hiện nay, lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume) được xếp trong nhóm IA trong sách đỏ Việt Nam, cần bảo tồn các quần thể nhỏ còn sót lại ở các Vườn Quốc gia và Khu Bảo tồn thiên nhiên, cũng như cần nghiên cứu nhân giống tạo hàng hóa xuất khẩu và bảo vệ nguồn gen. Ở Việt Nam do bị người dân thu hái tự phát để bán làm thuốc nên loài lan Kim tuyến đang bị đe dọa nghiêm trọng, rất có thể sẽ bị tuyệt chủng ngoài tự nhiên nếu chúng ta không có biện pháp bảo tồn hữu hiệu. Mặc dù vậy cho đến nay, ở nước ta vẫn chưa có bất kì công trình nghiên cứu nào về kỹ thuật nhân giống, gây trồng cho loài cây quý này được công bố. Do vậy, có thể nói việc nghiên cứu nhân nhanh loài lan Kim tuyến Anoectochilus setaceus Blume bằng phương pháp nhân giống in vitro vừa có ý nghĩa lý luận và ý nghĩa về mặt thực tiễn.

Những năm gần đây, đã có một số đề tài nghiên cứu về đặc điểm hình thái, phân bố và kỹ thuật nhân giống in vitro loài lan Kim tuyến này như:

Năm 2004, Nguyễn Văn Kiệt cũng đã đưa ra quy trình nhân giống in vitro thành công cho loài lan Kim tuyến Anoectochilus formosanus với vật liệu ban đầu là từ chồi đỉnh tại đại học Chungbuk, Hàn Quốc. Môi trường tạo vật liệu khởi đầu là H3 (Hyponex: 6,5N-4,5P-19K 1g/l + 20N-20P-20K 1g/l) + 2g/l peptone. Môi trường nhân nhanh là: H3 + 1mg/l BAP (hoặc 1-2mg/l TDZ) + 1% than hoạt tính.

Năm 2010, Phùng Văn Phê, Nguyễn Thị Hồng Gấm, Nguyễn Trung Thành. Đã đạt được những kết quả bước đầu trong nhân nhanh chồi in vitro loài Lan kim tuyến – Anoectochilus roxburghii (Wall.) Lindl.

Năm 2010,Phan Ngọc Khoa, Trường Đại học Khoa học Huế đã nghiên cứu ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng đến nhân giống in vitro lan Kim tuyến.”.

Các tác giả trên đã bước đầu tiến hành thăm dò ảnh hưởng của các chất điều tiết sinh trưởng và bước đầu tiến hành nhân giống thử nghiệm lan Kim tuyến nhưng chưa tác giả nào đưa ra quy trình hoàn chỉnh để nhân giống loài lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume). Do đó, trong nghiên cứu này, chúng tôi đặc biệt chú trọng đến nghiên cứu nhân nhanh và quy trình ra cây hoàn chỉnh cho loài thảo dược quý hiếm này.

II. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Đối tượng, vật liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu

2.1.1. Đối tượng nghiên cứu Cây lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume)

Mẫu chồi được tái sinh từ thân ngầm, thân khí sinh của cây lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume) được thu từ Vườn quốc gia Tam Đảo, Vĩnh Phúc.

2.1.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu

+ Địa điểm: Thí nghiệm được tiến hành tại Viện Sinh học Nông nghiệp, Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội và Phòng công nghệ tế bào Thực vật, Trung tâm Nghiên cứu Khoa học Sự sống, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên. + Thời gian: từ tháng 11/2011 – 12/2012

2.2. Mục tiêu nghiên cứu

– Xác định điều kiện khử trùng mẫu nuôi cấy thích hợp, tìm ra các môi trường thích hợp cho việc nhân nhanh in vitro. – Xác định điều kiện ra cây và bước đầu đưa cây ra vườn ươm.

2.3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

2.3.1. Ý nghĩa khoa học

– Đề tài sẽ cung cấp những dẫn liệu khoa học về loài lan (Anoectochilus setaceus Blume), chi Lan Kim tuyến. – Cung cấp những cơ sở khoa học về quy trình nhân giống in vitro lan Anoectochilus setaceus Blume. – Các kết quả nghiên cứu sẽ bổ sung thêm tài liệu khoa học phục vụ cho công tác giảng dạy, nghiên cứu khoa học về loài lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume).

2.3.2. Ý nghĩa thực tiễn

– Đề xuất được quy trình nhân giống in vitro cho lan Anoectochilus setaceus Blume. – Góp phần bảo tồn, thúc đẩy sản xuất cây Anoectochilus setaceu Blume như một nghề trồng lan mang lại giá trị kinh tế cao.

2.4. Nội dung nghiên cứu

2.4.1. Nghiên cứu xác định chất khử trùng, thời gian khử trùng và cơ quan vào mẫu thích hợp.

2.4.2. Nghiên cứu xác định môi trường khởi động và nhân nhanh thích hợp. + Xác định môi trường nền thích hợp.

+ Nghiên cứu ảnh hưởng của các nhóm chất điều tiết sinh trưởng đến sự phát sinh hình thành và hệ số nhân.

2.4.3. Nghiên cứu môi trường thích hợp cho sự ra rễ, tạo cây hoàn chỉnh.

2.4.4. Nghiên cứu điều kiện ra cây thích hợp cho loài lan Kim tuyến (Anoectochilus Setaceus Blume).

2.5. Phương pháp nghiên cứu

Điều kiện nuôi cấy – Mẫu được cấy trên môi trường đã được khử trùng ở 1,4 atm, 1210C – pH của môi trường là: 5,4. – Nhiệt độ phòng nuôi: 25±20C – Cường độ ánh sáng: 2000 lux – Thời gian chiếu sáng: 16 giờ chiếu sáng/ngày đêm

2.5.1. Phương pháp bố trí thí nghiệm

A. Xác định các phương pháp khử trùng tạo mẫu sạch

Thí nghiệm 1. Xác định chất khử trùng thích hợp

Chồi và mắt đốt ngang thân cây lan Kim tuyến sau thu hái, được rửa sạch bằng xà phòng, sau đó được thử nghiệm khử trùng bằng cồn 70o và H2O2 0,01% trong các khoảng thời gian khác nhau. Sau đó được rửa sạch lại nhiều lần bằng nước cất vô trùng rồi cấy vào môi trường vào mẫu là: 1/2MS + 0.2% than hoạt tính + 0,8% dịch chiết chuối. Thí nghiệm được tiến hành với các công thức khử trùng: CT1: Ngâm trong cồn 70⁰ trong 10s. CT2: Ngâm trong cồn 70⁰ trong 20s. CT3: Ngâm trong cồn 70⁰ trong 30s. CT4: Ngâm trong NaClO 2% trong 5 phút (300s). CT5: Ngâm trong NaClO 2% trong 10 phút (600s). CT6: Ngâm trong NaClO 2% trong 15 phút (900s). CT7: Ngâm trong cồn 70⁰ trong 10s rồi ngâm trong NaClO 2% trong 5 phút. CT8: Ngâm trong cồn 70⁰ trong 10s rồi ngâm trong NaClO 2% trong 10 phút. CT9: Ngâm trong cồn 70⁰ trong 10s rồi ngâm trong NaClO 2% trong 15 phút.

Thí nghiệm 2. Xác định cơ quan vào mẫu thích hợp nhất cho việc tạo mẫu sạch

Các cơ quan khác nhau là: Chồi đỉnh, chồi nách, mắt đốt ngang thân được khử trùng bằng công thức khử trùng hiệu quả nhất (rút ra ở Thí nghiệm 1). Theo dõi số mẫu sống, số mẫu bị nhiễm.

Thí nghiệm 3. Xác định cơ quan vào mẫu thích hợp đến hệ số nhân chồi in vitro

Cấy mẫu vào môi trường nhân cơ bản là MS + 0,5 mg/l BAP + 0,3 mg/l Kinetin + 100 ml/l ND + 100 g/l dịch chiết khoai tây + 20 g/l sucrose + 7 g/l agar. Mỗi loại vật liệu (chồi đỉnh, chồi nách, mắt đốt ngang thân) được bố trí 3 lần lặp lại, mỗi lần 7 mẫu.

B. Xác định môi trường khởi động và nhân nhanh thích hợp

Khi các mẫu sạch bệnh được chuyển sang môi trường nhân nhanh. Chúng tôi tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của các điều kiện nuôi trồng khác nhau đối với quá trình nhân nhanh. Mỗi công thức được bố trí 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại 7 mẫu, mỗi công thức là 21 mẫu.

Thí nghiệm 4. Xác định môi trường nền thích hợp cho nuôi cấy mô cây Lan Kim tuyến (A. setaceus)

Thí nghiệm được tiến hành dựa trên ba môi trường nền được sử dụng phổ biến hiện nay là MS, Knudson C và Knudson C cải tiến (Knud*). Các công thức được tiến hành trên nền môi trường chung là: Nền môi trường = 20g/l Sucrose + 100ml/l ND + 100ml/l dịch chiết khoai tây + 7g/l agar. CT1: Knud* + Nền môi trường CT2: MS + Nền môi trường CT3: Knudson C + Nền môi trường

Thí nghiệm 5. Nghiên cứu ảnh hưởng của nhóm chất cytokinin (BAP và kinetin) đến sự phát sinh hình thái và hệ số nhân

Sau khi tìm ra môi trường nền thích hợp trong thí nghiệm 4, thí nghiệm 5 tiếp tục tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của nhóm chất cytokinin tới khả năng phát sinh chồi lan Kim tuyến. Trong đó, môi trường nền sử dụng chung cho các công thức là: Nền môi trường = Môi trường nền (TNo4) + 20g/l Sucrose + 100ml/l ND + 100ml/l dịch chiết khoai tây + 7g/l agar. CT1: ĐC CT2: Nền môi trường + 0,1mg/l BAP CT3: Nền môi trường + 0,5mg/l BAP CT4: Nền môi trường + 1,0 mg/l BAP CT5: Nền môi trường + 2,0 mg/l BAP CT6: Nền môi trường + 0,1mg/l Kinetin CT7: Nền môi trường + 0,5mg/l Kinetin CT8: Nền môi trường + 1,0 mg/l Kinetin CT9: Nền môi trường + 2,0 mg/l Kinetin

Thí nghiệm 6. Nghiên cứu ảnh hưởng của nhóm chất Auxin (IBA và α-NAA) đến sự phát sinh hình thái và hệ số nhân

Thí nghiệm tiếp tục được tiến hành trên nền môi trường trên và thăm dò ảnh hưởng của auxin với các nồng độ khác nhau Nền môi trường = Môi trường nền (TNo4) + 20g/l Sucrose + 100ml/l ND + 100ml/l dịch chiết khoai tây + 7g/l agar. CT1: ĐC CT2: Nền môi trường +0,5 mg/l IBA CT3: Nền môi trường +1,0 mg/l IBA CT4: Nền môi trường +1,5 mg/l IBA CT5: Nền môi trường +2,0 mg/l IBA CT6: Nền môi trường +3,0 mg/l IBA CT7: Nền môi trường +0,5 mg/l α-NAA CT8: Nền môi trường +1,0 mg/l α-NAA CT9: Nền môi trường +1,5 mg/l α-NAA CT10: Nền môi trường +2,0 mg/l α-NAA CT11: Nền môi trường +3,0 mg/l α-NAA

Thí nghiệm 7. Nghiên cứu ảnh hưởng của sự phối hợp 2 nhóm chất là cytokinin và auxin đến sự phát sinh hình thái và hệ số nhân

Qua các kết quả thực nghiệm cho thấy, nồng độ BAP và Kinetin khi sử dụng phối hợp là 0,5mg/l và 0,3mg/l do đó thí nghiệm sẽ tiếp tục thăm dò ảnh hưởng của sự phối hợp 2 nhóm chất trên dựa trên nền môi trường: Nền môi trường = Môi trường nền (TNo4) + 0,5mg/l BAP + 0,3mg/l Kinetin + 20g/l Sucrose + 100ml/l ND + 100ml/l dịch chiết khoai tây + 7g/l agar. CT1: Nền môi trường +0,1mg/l IBA CT2: Nền môi trường +0,3mg/l IBA CT3: Nền môi trường +0,5mg/l IBA CT4: Nền môi trường + 0,1mg/l α-NAA CT 5: Nền môi trường +0,3mg/l α-NAA CT6: Nền môi trường +0,5mg/l α-NAA C. Nghiên cứu ra rễ tạo cây hoàn chỉnh

Khi các chồi lan Kim tuyến có chiều cao 3-4 cm, có 3-4 lá được cấy chuyển sang môi trường ra rễ. Chúng tôi tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nền (không có chất điều tiết sinh trưởng) và than hoạt tính đến sự ra rễ. Mỗi công thức được bố trí 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại 6 mẫu, mỗi công thức là 18 mẫu.

Thí nghiệm 8. Ảnh hưởng của môi trường nền (môi trường dinh dưỡng cơ bản) đến sự ra rễ

CT1: MS + 20g/l Sucrose + 7g/l agar CT2: MS/2 + 20g/l Sucrose + 7g/l agar CT3: Knud* + 20g/l Sucrose + 7g/l agar CT4: Knud*/2 + 20g/l Sucrose + 7g/l agar Thí nghiệm 9. Nghiên cứu ảnh hưởng của than hoạt tính đến sự ra rễ Các thí nghiệm được tiến hàn trên nền môi trường nghèo dinh dưỡng CT1= ĐC= Nền = MS + 20g/l Sucrose + 0% than hoạt tính + 7g/l agar CT2: Nền + 1% than hoạt tính CT3: Nền + 3% than hoạt tính CT4: Nền + 5% than hoạt tính D. Nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện chăm sóc tới khả năng sinh trưởng của loài lan Kim tuyến (Anoectochilus Setaceus Blume) in vitro ngoài vườn ươm. Cây cao 3-4cm, mọc 3-4 lá và có 3-4 rễ đủ tiêu chuẩn đưa ra ngoài vườn ươm. Cây in vitro cho ra khỏi môi trường tạo rễ, rửa sạch agar bám trên rễ, rồi trồng trong giá thể ngoài vườn ươm. * Cách bố trí thí nghiệm: – Thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên, mỗi công thức lặp lại 3 lần, mỗi chậu trồng 3 cây. – Định kì theo dõi: 7 ngày/1lần, chúng tôi đo chiều cao cây, đến rễ lá, số nhánh trong mỗi lần đo định kì. – Số cây theo dõi – Cách tưới: Phun mù dưới dạng sương mù vào lúc sáng sớm

Thí nghiệm 10. Nghiên cứu giá thể phù hợp cho việc ra cây loài Lan Kim tuyến (Anoectochilus Setaceus Blume) in vitro Giá thể:

CT 1: Giá thể 100% dớn CT 2: Giá thể 50% Dớn + 50% xơ dừa CT 3: Giá thể 100% xơ dừa CT 4: Giá thể 100% bột dừa

Thí nghiệm 11. Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian huấn luyện cây trong bình đến tỷ lệ sống của lan Kim tuyến khi trồng lên giá thể

Thí nghiệm được bố trí với thời gian huấn luyện cây khác nhau: ĐC: 0 ngày CT1: 4 ngày CT2: 8 Ngày CT3: 12 Ngày CT4: 16 ngày Cây sau khi huấn luyện sẽ được trồng vào giá thể là dớn và xơ dữa trộn lẫn trong nhà lưới được che kín bằng lưới đen.

Thí nghiệm 12. Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian che phủ ở nhà lưới đến tỷ lệ sống của lan Kim tuyến khi trồng lên giá thể

Cây Lan in vitro sau khi huấn luyện, đủ tiêu chuẩn đem ra trồng, sẽ được rửa sạch thạch và trồng lên giá thể ở nhà lưới. Luống cây sau khi trồng sẽ được che kín bằng nilon trắng, phía trên che bằng lưới đen có độ che sáng 50%. Thí nghiệm được bố trí với các khoảng thời gian che kín nilon khác nhau: ĐC: 0 ngày CT1: 5 ngày CT2: 10 Ngày CT3: 15 Ngày

2.5.2. Phương pháp đánh giá kết quả và xử lý số liệu

Các chỉ tiêu theo dõi

12. Chỉ tiêu thu thập: Tỷ lệ sống của cây con, đặc điểm của cây con

13. Thời gian thu thập: cứ 1 tuần quan sát và ghi số liệu 1 lần.

III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Nghiên cứu phương pháp khử trùng mẫu sạch và xác định cơ quan vào mẫu phù hợp cho việc nhân nhanh in vitro

Nhân giống in vitro có hệ số nhân giống cao, cây con tạo ra đồng nhất và sạch bệnh. Muốn vậy, trong bất kỳ quy trình nhân giống nào thì việc chọn vật liệu khởi đầu và việc tạo mẫu sạch in vitro chính là điều kiện tiên quyết để quyết định thành công của toàn bộ quá trình. Bởi vì đây chính là giai đoạn cung cấp nguồn mẫu sạch cho các giai đoạn tiếp theo của quá trình nhân giống. Mẫu sạch in vitro được tạo ra từ nhiều nguồn, có thể là từ các bộ phận sinh dưỡng (thân, lá, rễ, phát hoa…) hoặc từ cơ quan sinh sản (quả). Trong nghiên cứu này các loại vật liệu đã sử dụng là thân khí sinh, thân ngầm được cắt đoạn và cho vào mẫu để lựa chọn loại mẫu cấy phù hợp.

3.1.1. Xác định chất khử trùng thích hợp

Khử trùng mẫu là khâu quan trọng nhằm loại bỏ các nguồn nấm, vi khuẩn, virus khỏi mẫu, thu được nguồn mẫu vô trùng cho các nghiên cứu tiếp theo. Có nhiều yếu tố ảnh hưởng tới kết quả khử trùng như phương pháp lấy mẫu, thời điểm lấy mẫu, thời gian khử trùng, hóa chất khử trùng… Trong thí nghiệm này hóa chất được sử dụng là cồn 70⁰ và NaClO 2% bố trí ở các khoảng thời gian khác nhau. Sau khi khử trùng mẫu được cấy vào môi trường vào mẫu, sau một khoảng thời gian nhất định, thường là từ sau 2-3 tuần những mẫu sạch bắt đầu tái sinh. Đánh giá khả năng tái sinh là bước tiếp theo để tìm ra công thức khử trùng tốt nhất. Kết quả thu được sau 15 ngày thể hiện ở Bảng 3.1.

Bảng 3.1. Ảnh hưởng của chất khử trùng và thời gian khử trùng đến hiệu quả tạo mẫu sạch cây lan Kim tuyến (kết quả theo dõi sau 15 ngày)

Với chất khử trùng là cồn 70⁰ :

Cồn 700 là chất có tác dụng sát khuẩn và phá hủy thành cellulozo của tế bào thực vật nên khi kéo dài thời gian khử trùng thì tỷ lệ sống của mẫu giảm đồng thời tỷ lệ nhiễm cũng giảm. Kết quả ở bảng 3.1 cho thấy, thời gian khử trùng với cồn 70⁰ trong 10s (CT1) cho tỷ lệ mẫu sống cao nhất (47,62%) do thời gian ngắn thành tế bào ít bị phá hủy là nhưng tỷ lệ nhiễm cũng cao (52,38%) do chưa đủ để dung dịch khử trùng giết chết các nguồn bệnh. Khi tăng thời gian khử trùng lên 20s (CT2) thì tỷ lệ sống và tỷ lệ nhiễm giảm là 28,57% và 47,62%. Tiếp tục tăng thời gian khử trùng lên 30s (CT3) thì tỷ lệ sống tiếp tục giảm còn 14,29% và 38,1%.

Với chất khử trùng là NaClO 2%

NaClO 2% là hóa chất có tính sát khuẩn cao nên khi tăng thời gian khử trùng thì tỷ lệ nhiễm sẽ giảm nhưng nếu thời gian khử trùng lâu thì dung dịch có thể xâm nhập vào bên trong gây độc với mẫu. Kết quả ở bảng 3.1 cho thấy, khi khử trùng trong thời gian 5 phút (CT4) thì tỷ lệ nhiếm cao (23,81%) do thời gian chưa đủ để diệt các nguồn bệnh. Khi tăng thời gian khử trùng lên 10 phút (CT5) thì tỷ lệ nhiễm thấp nhất (9,52%), tỷ lệ sống cao (57,14%). Tiếp tục tăng thời gian khử trùng lên tới 15 phút(CT6) dung dịch đã gây độc cho mẫu nên tỷ lệ sống thấp hơn (33,33%), tỷ lệ nhiễm tăng lên. Như vậy, thời gian khử trùng bằng NaClO 2% tốt nhất là trong 10 phút, cho tỷ lệ sống cao và tỷ lệ nhiễm thấp. Khử trùng bằng phương pháp kết hợp giữa cồn 70⁰ và NaClO 2%

Khi kết hợp cả hai chất khử trùng trên với thời gian khử trùng thích hợp đã khắc phục được các nhược điểm của từng chất nên cho tỷ lệ sống cao hơn và tỷ lệ nhiễm giảm. Kết quả thí nghiệm cho thấy, phương pháp khử trùng là ngâm cồn 70⁰ trong 10s rồi ngâm trong NaClO 2% trong 10 phút (CT8) cho tỷ lệ sống cao nhất đạt 90,48% và tỷ lệ nhiễm thấp (28,57%).

Như vậy, thời gian khử trùng mẫu có ảnh hưởng khá lớn tới tỷ lệ sống của mẫu cấy. Công thức khử trùng CT8 (ngâm trong cồn 70⁰ trong 10s rồi ngâm trong NaClO 2% trong 10 phút) là vừa đủ, vừa có khả năng tiêu diệt mầm bệnh mà lại tác động nhẹ đến thành tế bào nên cho tỷ lệ sống cao và kích thích mẫu tái sinh.

3.1.2. Xác định cơ quan vào mẫu thích hợp để tạo mẫu sạch và tăng hệ số nhân chồi in vitro

Mục tiêu đặt ra của quy trình khử trùng cho bất kỳ loài cây nào đều là tạo được tỷ lệ mẫu sạch cao đồng thời có khả năng tái sinh mạnh. Một trong các yếu tố chính ảnh hưởng đến khả năng này là bản chất vật liệu làm mẫu cấy. Mẫu cấy tiếp xúc với nước, đất như rễ thường có lượng vi sinh vật rất cao và khó loại bỏ hoàn toàn chúng khỏi nguồn mẫu. Mẫu mọng nước, có lông thường khó khử trùng hơn những mẫu không mọng nước, bề mặt nhẵn. Trong nghiên cứu này các vật liệu được khử trùng được khử trùng theo công thức khử trùng tốt nhất suy ra từ kết quả nghiên cứu phần 3.1.1

3.1.2.1. Ảnh hưởng của loại vật liệu đến tỷ lệ tạo mẫu sạch Qua kết quả thí nghiệm 1 cho thấy, điều kiện khử trùng hiệu quả nhất đối với loài Lan Kim tuyến là: Ngâm trong cồn 70o trong 10s sau đó ngâm trong NaClO 2% trong 10 phút. Do đó, để xác định cơ quan vào mẫu phù hợp nhất thí nghiệm tiếp tục áp dụng điều kiện khử trùng trên với các vật liệu khác nhau của cây lan Kim tuyến là: Chồi đỉnh, chồi nách, mắt đốt ngang thân. Kết quả thu được sau 15 ngày được thể hiện ở Bảng 3.2.

Bảng 3.2. Ảnh hưởng của loại vật liệu đến tỷ lệ tạo mẫu sạch (Kết quả thu được sau 15 ngày)

Qua kết quả nghiên cứu ở thí nghiệm này cho thấy, cơ quan vào mẫu thích hợp cho việc tạo mẫu sạch là mắt đốt ngang thân.

3.1.2.2. Ảnh hưởng của cơ quan vào mẫu đến hệ số nhân chồi in vitro C

ơ quan vào mẫu có ảnh hưởng rõ rệt đến hệ số nhân chồi. Ở một số loài, cơ quan vào mẫu có tỷ lệ mẫu sạch bệnh cao nhất nhưng lại cho hệ số nhân chồi thấp nhất. Do đó, để đạt hiệu quả nhân nhanh chồi in vitro loài lan Kim tuyến, chúng tôi tiến hành thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của cơ quan vào mẫu đến hệ số nhân chồi lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume). Kết quả thí nghiệm thu được thể hiện qua Bảng 3.3. Bảng 3.3. Ảnh hưởng của cơ quan vào mẫu đến hệ số nhân chồi in vitro (kết quả theo dõi sau 8 tuần).

Phân tích phương sai một nhân tố với 3 lần lặp của tỷ lệ mẫu sạch, hệ số nhân và chiều cao chồi đều được hiệu của trung bình mỗi công thức lớn hơn LSD0,05 chứng tỏ cơ quan vào mẫu có ảnh hưởng rõ rệt đến tỷ lệ tạo chồi, hệ số nhân và chiều cao TB chồi ở độ tin cậy 95%.

Qua kết quả ở Bảng 3.3 cho thấy, khi cấy các vật liệu là chồi đỉnh, chồi nách, mắt đốt ngang thân vào môi trường nhân nhanh phù hợp, kết quả theo dõi sau 8 tuần cho thấy mắt đốt ngang thân là cơ quan tái sinh và phát triển tốt nhất với tỷ lệ tạo mẫu là 100%, hệ số nhân 4,56 lần, chồi dài 3,2 cm. Cơ quan nhân kém nhất là chồi đỉnh với tỷ lệ tạo chồi chỉ đạt 33,33%, hệ số nhân là 2,11 lần và chiều dài chồi là 2,6 cm. Chồi nách cho tỷ lệ tạo mẫu là 44,44%, hệ số nhân 3,5 lần và chiều dài chồi 2,95 cm.

Như vậy, cơ quan vào mẫu thích hợp nhất để tăng hệ số nhân chồi in vitro lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus) là mắt đốt ngang thân.

3.2. Nghiên cứu môi trường khởi động và nhân nhanh thích hợp

Trong nuôi cấy in vitro, môi trường nuôi cấy đóng vai trò quan trọng. Vừa phải cung cấp chất dinh dưỡng cho mẫu vừa phải biệt hoá mẫu theo những hướng xác định. Do đó nghiên cứu lựa chọn môi trường nuôi cấy phù hợp nhất sẽ cho hệ số nhân cao, chất lượng chồi tốt.

3.2.1. Xác định môi trường nền thích hợp cho nuôi cấy mô Lan Kim tuyến (A. setaceus)

Những nghiên cứu về nuôi cấy Phong lan in vitro cho thấy có một số môi trường thích hợp để nuôi cấy Phong lan như: MS; môi trường Knudson C cho Cattleya, Cymbidium (Adirti, 1993), môi trường Knudson cải tiến (Knud*), môi trường Hyponex (Lou and Kako,1995; Nakano et al, 2000…), môi trường Vaccin &Went… Trong đề tài này chúng tôi nghiên cứu nuôi cấy loài Lan Kim tuyến trên ba loại môi trường cơ bản: MS, Knudson C và Knud*.

Thể chồi 4 tuần tuổi từ môi trường vào mẫu được cấy vào các môi trường khác nhau là MS, Knud*, Knudson có bổ sung thêm 20g/l sucrose + 100ml/l ND + 100ml/l dịch chiết khoai tây + 7g/l agar. Sau 8 tuần nuôi cấy ta thu được kết quả sau:

Bảng 3.4. Ảnh hưởng của môi trường nền đến khả năng nhân nhanh chồi, mắt đốt lan Kim tuyến

Kết quả phân tích phương sai cho thấy, môi trường nền có ảnh hưởng tới khả năng nhân nhanh chồi, mắt đốt lan Kim tuyến. Theo kết quả ở Bảng 3.4 thấy rằng môi trường Knud* cho số lượng chồi (3,67 chồi/mẫu) và số lá (4,12 lá/chồi) nhiều hơn ở môi trường MS (số lượng chồi 2,11 chồi/mẫu và số lá 1,55 lá/chồi) và Knudson (số lượng chồi 2,06 chồi/mẫu và số lá 2,35 lá/chồi). Đồng thời, trong môi trường Knud* thì chiều dài chồi (3,57cm) dài hơn hẳn so với hai môi trường còn lại (MS là 1,33 cm và Knudson là 2,22 cm) và chất lượng chồi cũng tốt hơn chồi mập, xanh. Như vậy, môi trường nền thích hợp nhất cho nuôi cấy mô lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus) là nuôi trường có nguồn gốc Knud*.

3.2.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của nhóm chất điều hòa sinh trưởng riêng rẽ và phối hợp đến sự phát sinh hình thái và hệ số nhân

Chất điều hoà sinh trưởng không những là công cụ hữu ích giúp chúng ta nghiên cứu sâu hơn về sự phát sinh hình thái thực vật mà còn giúp ta chủ động định hướng cho sự phát triển của thực vật trong ống nghiệm. Đặc biệt với mục đích nhân giống tạo số lượng lớn trong thời gian ngắn thì việc sử dụng các loại chất điều tiết sinh trưởng ở nồng độ khác nhau cho tỷ lệ mẫu tái sinh lớn nhất là tất yếu.

3.2.2.1. Ảnh hưởng của nhóm chất Cytokinin đến sự phát sinh hình thái và hệ số nhân

Cytokinin được biết đến là nhóm chất điều hòa sinh trưởng có tác dụng kích thích sự phân chia tế bào, sự hình thành và sinh trưởng của chồi in vitro (Miller, 1961). Để tăng hệ số nhân giống, người ta tăng nồng độ cytokinin trong môi trường nuôi cấy ở giai đoạn tạo chồi in vitro (Nguyễn Quang Thạch, 2007). Các loại cytokinin thường được sử dụng trong nuôi cấy như: BAP, Kinetin, TDZ, Zeatin…

Trong thí nghiệm này, hai loại cytokinin là BAP và Kinetin được dùng với các nồng độ khác nhau là 0,1; 0,5; 1,0 và 2,0 mg/l trên môi trường (Knud* + 20g/l Sucrose + 100ml/l ND + 100ml/l dịch chiết khoai tây + 7g/l agar). Kết quả thu được ở Bảng 3.5.

Bảng 3.5. Ảnh hưởng của nhóm chất Cytokinin đến sự phát sinh hình thái và hệ số nhân (kết quả theo dõi sau 8 tuần)

Ảnh hưởng của BAP đến sự phát sinh hình thái và hệ số nhân chồi

Kết quả xử lý thống kê hàm Anova một nhân tố cho thấy, giữa các công thức có sự khác biệt rõ rệt về số lượng chồi, số đốt và chiều cao chồi ở độ tin cậy 95% và khác biệt so với đối chứng.

Theo kết quả thu được ở Bảng 3.5 cho thấy, môi trường có bổ sung 1,0 mg/l BAP cho số chồi và số đốt cao hơn nhất (5,22 chồi/mẫu và 2,93 đốt/chồi), chiều cao chồi cũng lớn nhất (3,23 cm). Ở các môi trường có nồng độ BAP khác thì thấp hơn, số lượng chồi khi sử dụng nồng độ 0,1 mg/l BAP là 2,44 chồi/mẫu, ở nồng độ 0,5 mg/l BAP là 3,94 chồi/mẫu, ở nồng độ 2,0 mg/l là 4,22 chồi/mẫu và đối chứng là 1,22 chồi/mẫu, số đốt khi sử dụng các nồng độ 0,1; 0,5; 2,0 mg/l BAP lần lượt là 2,16; 2,33; 2,35 đốt/chồi và đối chứng là 1,54 đốt/chồi. Về chất lượng chồi thì ở nồng độ 1,0 mg/l BAP cũng cho chất lượng chồi tốt nhất chồi to khỏe, xanh đậm còn ở nồng độ 0; 0,1 và 2,0 mg/l thì do nồng độ quá cao và quá thấp nên chồi nhỏ và yếu, xanh nhạt. Như vậy, việc bổ sung BAP ở nồng độ 1,0 mg/l là thích hợp nhất cho sự phát sinh hình thái và hệ số nhân chồi lan Kim tuyến.

Ảnh hưởng của Kinetin đến sự phát sinh hình thái và hệ số nhân chồi

Kết quả xử lý thống kê hàm Anova một nhân tố cho thấy, giữa các công thức có sự khác biệt rõ rệt về số lượng chồi, số đốt và cả chiều cao chồi ở độ tin cậy 95% và khác biệt so với đối chứng. Theo kết quả thu được ở Bảng 3.5 cho thấy, môi trường có bổ sung 1,0 mg/l Kinetin cũng cho số chồi và số đốt cao hơn nhất (4,91 chồi/mẫu và 2,68 đốt/chồi), chiều cao chồi cũng lớn nhất (3,23 cm). Ở các môi trường có nồng độ Kinetin khác thì thấp hơn, số lượng chồi dao động từ 2,33 – 4,22 chồi/mẫu, số đốt dao động từ 1,98 – 2,45 đốt/chồi. Về chất lượng chồi thì ở nồng độ 1,0 mg/l BAP cũng tốt nhất chồi to khỏe, xanh đậm còn ở nồng độ 0; 0,1 và 2,0 mg/l thì chồi nhỏ, xanh nhạt. Như vậy, bổ sung Kinetin cũng ở nồng độ 1,0 mg/l là thích hợp nhất cho sự phát sinh hình thái và hệ số nhân chồi lan Kim tuyến.

3.2.2.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của IBA và αNAA đến sự phát sinh hình thái và hệ số nhân lan Kim tuyến (A. setaceus)

Tác dụng rõ nét nhất của auxin đối với sự phân hóa tế bào là khả năng phát sinh rễ đã được kiểm chứng từ năm 1934 (Went, Skoog, Thimann). Nhiều nghiên cứu đã cho thấy vai trò của IBA và αNAA tác động đến quá trình phát sinh rễ trên nhiều đối tượng nghiên cứu như cây lát hoa Côn Đảo, tram Úc… (Trần Văn Minh và Cộng sự, 2003; Nguyễn Văn Nghi và Cộng sự, 2003). Để kiểm tra ảnh hưởng của auxin (IBA và NAA) tới sự phát sinh hình thái và hệ số nhân, thí nghiệm này được tiến hành trên môi trường Knud* và bổ sung riêng rẽ IBA và αNAA với các nồng độ khác nhau 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 3,0mg/l + 20g/l Sucrose + 100ml/l ND + 7g/l agar. Kết quả thu được ở Bảng 3.6.

Bảng 3.6. Ảnh hưởng của auxin (IBA và αNAA) tới sự phát sinh hình thái lan Kim tuyến

Sau 8 tuần nuôi cấy trong môi trường có bổ sung auxin IBA và αNAA với các dải nồng độ từ 0,5-3,0 mg/l thu được kết quả trong Bảng 3.6. Kết quả cho thấy, IBA và αNAA có hiệu quả sản sinh rễ bất định, αNAA có hiệu quả sản sinh rễ lớn hơn IBA nhưng hiệu quả sản sinh rễ không rõ ràng ở cả 2 loại phytohormon trên. Số lượng rễ và chiều dài rễ không khác biệt nhiều giữa các công thức. Trái lại, hai loại auxin này lại có hiệu quả rõ rệt trong việc sản sinh chồi bất định và đạt kết quả lớn và khác biệt hẳn giữa các công thức. Cụ thể là IBA ở nồng độ (1,5mg/l) cho 4,87 chồi/mẫu và αNAA (1,0mg/l) cho 4,55 chồi/mẫu. Lá cây có màu xanh đậm nhưng kích thước lá nhỏ hơn so với cytokinin. Trong rất nhiều các thí nghiệm và tài liệu nghiên cứu, các loại auxin như IBA, αNAA, 2,4 D, IAA được sử dụng để sản sinh rễ cho hầu hết các loại cây nhưng trong thí nghiệm này, đối với cây lan Kim tuyến (A. setaceus) IBA và αNAA không có hiệu quả sản sinh rễ bất định.

3.2.2.3.Ảnh hưởng của sự phối hợp 2 nhóm chất là auxin và cytokinin đến sự phát sinh hình thái và hệ số nhân

Nhiều tác giả đã tổng kết rằng sự biệt hóa cơ quan thực vật in vitro là kết quả tác động qua lại giữa hai nhóm auxin và cytokinin. Tỷ lệ auxin/cytokinin cao sẽ kích thích sự ra rễ, trái lại sẽ đẩy mạnh sự biệt hóa chồi, ở tỷ lệ trung bình thì hình thành mô sẹo. Để nghiên cứu nhân nhanh nhằm thu được các chồi có chất lượng tốt cho các giai đoạn tiếp theo, chúng tôi tiến phối hợp giữa BAP, Kinetin và αNAA, IBA với các nồng độ khác nhau kết thu được từ thí nghiệm trên, BAP và kinetin khi sử dụng phối hợp theo tỷ lệ 0,5mg/l BAP + 0,3mg/l kinetin cho hiệu quả nhân nhanh tốt. Do đó, thí nghiệm được tiến hành trên nền môi trường trên phối hợp với IBA và α-NAA với các dải nồng độ từ 0,1 – 0,5 mg/l + 20g/l Sucrose + 20g/l ND + 100ml/l dịch chiết khoai tây + 7g/l agar. Kết quả thí nghiệm được thể hiện qua Bảng 3.6.

Bảng 3.6. Ảnh hưởng của sự phối hợp 2 nhóm chất là auxin và cytokinin đến sự phát sinh hình thái và hệ số nhân (kết quả theo dõi sau 8 tuần)

Theo kết quả ở Bảng 3.6: Mẫu cấy trên môi trường chứa tổ hợp 0,5 mg/l BAP + 0,3 mg/l Kinetin + 0,3mg/l α-NAA cho số chồi cao nhất đạt (6,56 chồi/mẫu) nhiều hơn so với môi trường chứa tổ hợp 0,5 mg/l BAP + 0,3 mg/l Kinetin + 0,5mg/l IBA (4,85 chồi/mẫu) nhưng số đốt và chiều cao chồi thì lại thấp hơn. Sự phối hợp giữa cytokinin và auxin cho số chồi, số đốt và chiều cao chồi cao nhất (6,56 chồi/mẫu, 2,77 đốt/chồi và chiều cao trung bình chồi đạt 3,52 cm).

Như vậy, qua kết quả nghiên cứu về ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng tới sự phát sinh hình thái và hệ số nhân chồi thấy rằng công thức môi trường thích hợp nhất để nhân nhanh là: Knud* +0,5mg/l BAP + 0,3mg/l Kinetin + 0,3 mg/l α-NAA + 20g/l Sucrose + 20g/l ND + 100ml/l dịch chiết khoai tây + 7g/l agar cho hệ số nhân cao, chất lượng chồi tốt, xanh, lá khỏe.

3.3. Nghiên cứu ra rễ tạo cây hoàn chỉnh

Cây nuôi cấy mô in vitro trước khi chuyển ra vườn ươm thường phải có bộ rễ hoàn chỉnh. Nếu rễ kém phát triển sẽ làm cho quá trình hút nước cũng như khả năng bám đất của cây bị ảnh hưởng nhưng ngược lại, bộ rễ phát triển mạnh sẽ làm ảnh hưởng tới chất lượng của các cơ quan khác. Do đó cần nghiên cứu để tìm ra môi trường ra rễ thích hợp cho cây. Khi các chồi đạt tiêu chuẩn cho ra rễ, có chiều cao 3 – 5 cm , có 3 – 4 rễ, chồi mập khỏe, lá to, xanh thì được chuyển sang các môi trường ra rễ để tạo cây hoàn chỉnh. Qua thí nghiệm trên, hai loại auxin là IBA và α-NAA đã được tiến hành nghiên cứu và cho kết quả là không có khả năng sản sinh ra rễ bất định đối với lan Kim tuyến (A. setaceus). Do đó trong nghiên cứu tạo cây hoàn chỉnh chúng tôi tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện nghèo dinh dưỡng và than hoạt tính đến sự ra rễ ở cây lan Kim tuyến (A. setaceus).

3.3.1. Ảnh hưởng của môi trường nền (môi trường không có chất điều tiết sinh trưởng) đến sự ra rễ

Lan Kim tuyến là một loại cây có yêu cầu về dinh dưỡng thấp, khi sống ở các môi trường nghèo dinh dưỡng thì rễ lan Kim tuyến sẽ kéo dài hơn để lấy dinh dưỡng cho cây. Chúng tôi tiến hành nghiên cứu cho cây ra rễ trên môi trường nền nghèo dinh dưỡng, không có chất kích thích sinh trưởng để đánh giá môi trường nền ra rễ thích hợp và đánh giá khả năng ra rễ của mẫu Lan Kim tuyến trong điều kiện nghèo dinh dưỡng. Kết quả được trình bày ở Bảng 3.7.

Bảng 3.7. Ảnh hưởng của môi trường nền (môi trường không có chất điều tiết sinh trưởng) đến sự ra rễ (kết quả theo dõi sau 8 tuần)

Theo kết quả ở Bảng 3.7 cho thấy, môi trường Knud*/2 cho tỷ lệ tạo rễ cao nhất (100%), số lượng rễ nhiều nhất (2,17 rễ/chồi) và chiều dài rễ cũng cao nhất (2,47 cm), chồi mập và dài. Các môi trường khác đều cho các chỉ tiêu này thấp hơn, tỷ lệ tạo chồi dao động từ 66,67 – 83,33%; số lượng rễ dao động từ 1,25 – 1,87 rễ/chồi; chiều dài rễ đao động từ 1,6 – 2,3 cm; chồi ngắn hơn. Như vậy có thể thấy rằng môi trường nghèo dinh dưỡng sẽ kích thích bộ rễ Lan Kim tuyến phát triển mạnh hơn và phát triển theo hướng phát triển chiều dài rễ.

3.3.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của than hoạt tính đến sự ra rễ

Vai trò tích cực của than hoạt tính đã được chứng minh trong nhiều nghiên cứu trên các đối tượng khác nhau. Theo đó, than hoạt tính có tác dụng hấp thụ các chất màu, các hợp chất phenol, các sản phẩm trao đổi thứ cấp… Và đặc biệt, than hoạt tính làm thay đổi môi trường ánh sáng do làm cho môi trường sẫm màu, nên có thể kích thích sự hình thành và sinh trưởng của rễ (Vũ Văn Vụ, 2006). Vì vậy, trong thí nghiệm này chúng tôi sử dụng than hoạt tính với các nồng độ khác nhau bổ sung vào môi trường Knud* + 20g/l Sucrose + 7g/l agar để xác định vai trò của than hoạt tính đối với sự ra rễ của cây Lan Kim tuyến. Kết quả trình bày ở Bảng 3.8.

Bảng 3.8. Ảnh hưởng của than hoạt tính đến sự ra rễ (kết quả theo dõi sau 8 tuần)

Kết quả xử lý thống kê hàm Anova một nhân tố cho thấy, nồng độ than hoạt tính khác nhau rõ ràng có ảnh hưởng đến tỷ lệ tạo rễ và chiều dài rễ và số lượng rễ của Lan Kim tuyến nuôi cấy mô. Kết quả ở Bảng 3.8 cho thấy, bổ sung than hoạt tính vào môi trường nuôi cấy rõ ràng là có ảnh hưởng tích cực hơn đến sự hình thành của rễ cây lan Kim tuyến. Ở tất cả các môi trường bổ sung than hoạt tính đều cho tỷ lệ tạo rễ là 100%. Bổ sung than hoạt tính ở nồng độ 5% cho số lượng rễ nhiều nhất (4,22 rễ/chồi) và chiều cao rễ là 3,5 cm. Trong khi đó ở các nồng độ khác thì số lượng rễ thấp hơn dao động từ 2 – 3,83 rễ/chồi, đối chứng chỉ có 1,25 rễ/chồi, chiều cao dao động từ 2,89 – 3,2 cm, đối chứng là 1,6 cm. Chất lượng rễ của mẫu cấy ở môi trường có bổ sung 5% than hoạt tính là dài, mập và rất khỏe, ở cá nồng độ khác thì rễ ngắn và yếu hơn.

Căn cứ vào các chỉ tiêu đánh, chúng tôi cho rằng, than hoạt tính ở nồng độ 5% là có tác dụng kích thích sự hình thành và phát sinh rễ lan Kim tuyến tốt nhất

3.4. Nghiên cứu điều kiện ra cây thích hợp cho loài lan Kim tuyến (A. setaceus Blume) in vitro

3.4.1. Nghiên cứu giá thể phù hợp nhất cho việc ra cây loài lan Kim tuyến (A. setaceus Blume) in vitro

CT 1: Giá thể 100% dớn CT 2: Giá thể 50% Dớn + 50% xơ dừa CT 3: Giá thể 100% xơ dừa CT 4: Giá thể 100% bột dừa Các giá thể được làm sạch, sấy khô và được ngâm nước trước khi đưa vào sử dụng. Sau 2 tuần đưa cây ra ngoài giá thể chúng tôi thu được kết quả theo Bảng 3.9

Bảng 3.9. Ảnh hưởng của giá thể tới sinh trưởng và tỷ lệ sống của cây lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume)

Từ Bảng kết quả thu được, chúng tôi nhận thấy trên các giá thể khác nhau, tỷ lệ sống sót, khả năng sinh trưởng, phát triển của cây cũng rất khác nhau. Tỷ lệ sống sót và khả năng sinh trưởng tốt nhất của các cây con đạt được ở giá thể gồm 50% Dớn và 50% xơ dừa (CT2). Ở giá thể này, cây thích ứng rất nhanh, chỉ sau 7 -10 ngày trồng cây đã có biểu hiện sinh trưởng rõ rệt. Cây to, mập, lá có màu xanh đậm và cho tỷ lệ sống cao nhất đạt 66,32% và thấp nhất ở giá thể bột dừa đạt 33,76%.

Tuy Dớn và xơ dừa là giá thể phù hợp nhất cho loài lan Kim tuyến Anoectochilus setaceus Blume nhưng tỷ lệ sống thu được không cao do đó chúng tôi tiếp tục tiến hành các thí nghiệm nhằm nâng cao tỷ lệ sống cho giống lan in vitro này.

3.4.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian huấn luyện cây trong bình đến tỷ lệ sống của lan Kim tuyến khi trồng lên giá thể

Mục đích của giai đoạn huấn luyện là tạo điều kiện cho cây trong môi trường in vitro dần làm quen với môi trường tự nhiên bên ngoài. Sau khi được huấn luyện, cây con sẽ cứng cáp, khoẻ mạnh hơn và đạt tỷ lệ sống cao khi đưa ra trồng ngoài nhà lưới, vườn ươm… Có thể coi giai đoạn này như giai đoạn thuần hoá cây trước khi tách khỏi điều kiện in vitro.

Trong điều kiện in vitro, cây con được nuôi cấy trong môi trường dinh dưỡng, ánh sáng nhân tạo và vô trùng, tức là đã quen sống dị dưỡng. Khi đưa cây con ra trồng trên giá thể ở ngoài tự nhiên, cây con phải sống tự dưỡng, xung quanh là môi trường không vô trùng, ánh sáng tự nhiên. Do vậy, huấn luyên cây in vitro cũng giúp cây chuyển từ trạng thái dị dưỡng sang trạng thái bán tự dưỡng, để khi đưa cây ra trồng ngoài vườn ươm cây có thể tự dưỡng ngay mà không ảnh hưởng đến sự sinh trưởng. Thời gian huấn luyện khác nhau giúp cây có khả năng thích nghi với điều kiện môi trường bên ngoài bình khác nhau, do đó có ảnh hưởng đến tỷ lệ sống cảu cây con khi đưa ra trồng ngoài vườn ươm.

3.4.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của chế độ huấn luyện cây ở nhà lưới đến tỷ lệ sống của lan Kim tuyến khi trồng lên giá thể

Bảng 3.11. Ảnh hưởng của chế độ huấn luyện cây ở nhà lưới đến tỷ lệ sống của lan Kim tuyến khi trồng lên giá thể

Công thức CT2 và CT3 có tỷ lệ cây sống cao nhất (99%) và thấp nhất là công thức ĐC (80,33%). Sức sống của cây con ở các thời gian che bóng khác nhau cũng khác nhau khá rõ. Công thức CT2 cây phát triển tốt nhất, cây mập, lá dày và xanh non, rễ phát triển và bám giá thể tốt. Công thức CT5 rễ bám giá thể khá tốt nhưng cây mảnh và lá mỏng mang màu xanh nhạt hơn ở công thức CT2.

Công thức ĐC cho tỷ lệ cây sống thấp nhất. Tuy cây phát triển khá tốt nhưng độ bám của rễ vào giá thể rất kém nên không đạt tiêu chuẩn.

Những ngày đầu đưa cây ra trồng ở nhà lưới/vườn ươm, luống cây được phủ kín nilon để giúp cây con tránh bị mất nước do bay hơi. Nếu luống cây không được che kín bằng nilon, cây con sẽ bị mất nước khi trời nắng hoặc gió lùa khiến cho cây bị héo và chết. Tuy nhiên, thời gian che kín luống cây bằng nilon kéo dài sẽ khiến cây bị quá thiếu ánh sáng dẫn đến bị “ớm”, cây cao nhưng mảnh và lá xanh nhạt làm khả năng quang hợp kém, hay ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của cây con.

Như vậy, khi đưa lan Kim tuyến ra trồng ở vườn ươm thì nên che bóng trong vòng 10 ngày là thích hợp.

IV. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

4.1. Kết luận

Dựa vào kết quả thu được từ các thí nghiệm chúng tôi rút ra các kết luận sau:

1. Phương pháp khử trùng tạo mẫu sạch in vitro và cơ quan vào mẫu thích hợp:

Rửa sạch bằng xà phòng rồi đem ngâm trong cồn 70o trong 10s sau đó ngâm trong NaClO 2% trong 10 phút. Cơ quan vào mẫu thích hợp nhất là mắt đốt ngang thân, cho tỷ lệ sống cao đạt khoảng 72%, tỷ lệ tạo chồi là 100% và hệ số nhân đạt 4,56 lần

2. Môi trường khởi động và nhân nhanh thích hợp:

– Môi trường nền thích hợp để nhân nhanh Lan kim tuyến (A. setaceus) là môi trường Knud* + 20g/l sucrose + 100ml/l ND + 100ml/l dịch chiết khoai tây + 7g/l agar – Môi trường: Knud* + 1,0 mg/l BAP hoặc 1,0 mg/l Kinetin + 20g/l Sucrose + 100ml/l ND + 100ml/l dịch chiết khoai tây + 7g/l agar. – Môi trường nhân nhanh phù hợp nhất: Knud* + 0,5mg/l BAP + 0,3 Kinetin + 0,3mg/l αNAA + 20g/l sucrose + 100ml/l ND + 100ml/l dịch chiết khoai tây + 7g/l agar.

3. Xác định môi trường ra rễ tạo cây hoàn chỉnh:

– Môi trường phù hợp nhất cho sự ra rễ ở loài Lan kim tuyến là Knud*/2 + 5% than hoạt tính.

4. Xác định điều kiện ra cây thích hợp với loài Lan Kim tuyến

– Giá thể phù hợp nhất với loài Lan Kim tuyến là: 50% Dớn + 50% xơ dừa. – Thời gian huấn luyện cây trong bình phù hợp nhất là 8 ngày – Thời gian che luống cây phù hợp nhất là 10 ngày cho tỷ lệ cây sống là 99%

4.2. Đề nghị

Do thời gian quá ngắn nên cây lan Kim tuyến vẫn chưa được đưa vào sản xuất trên quy mô công nghiệp nên chúng tôi đề nghị tiếp tục nhân và sản xuất ra với số lượng lớn nhằm bảo vệ nguồn dược liệu quý và đáp ứng nhu cầu sử dụng lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume) hiện nay.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Nguyễn Tiến Bân (chủ biên), Danh lục các loài thực vật Việt Nam, Tập 3, Nxb. Nông nghiệp, Hà Nội, 2005. 2. Bộ Khoa học và Công nghệ, Sách Đỏ Việt Nam (phần thực vật), Nxb. Khoa học Tự nhiên & Công nghệ, Hà Nội, 2007. 3. Chính Phủ Nước Cộng hòa xã hội chủ nghĩa Việt Nam, Nghị định số 32/2006/NĐ-CP, 2006. 4. Lê Thị Kim Đào, “Nghiên cứu thử nghiệm nhân một số giống cây trồng rừng bằng phương pháp nuôi cấy mô (Bạch đàn, cây Hông, Giổi xanh, Trầm hương)”, Tạp chí sinh học, 23, 3, tr.46-50, 2001. 5. Phạm Hoàng Hộ, Cây cỏ Việt Nam, Quyển 3, Nxb. Trẻ, Tp. Hồ Chí Minh, 2000. 6. Dương Công Kiên, Nuôi cấy mô thực vật, Nxb. Đại học Quốc gia Tp. Hồ Chí Minh, 2002. 7. Nguyễn Thị Hồng Gấm, Nghiên cứu kỹ thuật nhân giống Lan Ngọc Điểm Tai Trâu (Rhynchostylis gigantea) bằng phương pháp nuôi cấy trong ống nghiệm, Báo cáo khoa học Trường Đại học Lâm nghiệp, 2007. 8. Phùng Văn Phê và nnk, Nghiên cứu kỹ thuật nhân giống In vitro loài Lan kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume), Báo cáo khoa học Trường Đại học Lâm nghiệp, 2009. 9. Phùng Văn Phê, Nguyễn Thị Hồng Gấm, Nguyễn Trung Thành, Nghiên cứu kỹ thuật nhân nhanh chồi In vitro loài Lan Kim tuyến (Anoectochilus roxburghii (Wall.) Lindl)”, Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, 26(4), 248-253, 2010. 10. Phùng Văn Phê, Nguyễn Trung Thành, Vương Duy Hưng. “Đặc điểm hình thái, phân bố của loài Lan Kim tuyến Anoectochilus setaceus Blume ở Vườn Quốc gia Tam Đảo, tỉnh Vĩnh Phúc”, Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, 26(2), 104-109, 2010. 11. Nguyễn Thị Quỳnh (2005), “Nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố môi trường lên sự tăng trưởng của một số cây thân gỗ nhiệt đới và cận nhiệt đới trong điều kiện nuôi cấy in vitro”, Hội nghị tổng kết NCCB trong KHTN, tr. 42-44, 2005. 12. Nguyễn Đức Thành, Nuôi cấy mô, tế bào thực vật, Nghiên cứu ứng dụng, Nhà xuất bản Nông nghiệp, Hà Nội, 2000. 13. Vũ Văn Vụ, Vũ Thanh Tâm, Hoàng Minh Tấn, Sinh lý học thực vật, Nxb. Giáo dục, Hà Nội, 2007.

Tài liệu từ Internet:

53. Kim Sinh (2011). “Đua nhau vào rừng sâu “săn”…cỏ !”, http://baoxuan.giadinh.net.vn/30635p0c1000/dua-nhau-vao-rung-sau-san-co.htm. 54. http://congnghexanhviet.com/San-pham/Giong-cay-trong/28/GIONG-CAYCHAT-LUONG-CAO.html 55. http://caythuocviet.com.vn/cay-thuoc-vi-thuoc/Lan-kim-tuyen.html

Tác giả

Phí Thị Cẩm Miện. LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC. NGHIÊN CỨU NHÂN NHANH IN VITRO LOÀI LAN KIM TUYẾN (ANOECTOCHILUS SETACEUS BLUME) NHẰM BẢO TỒN NGUỒN DƯỢC LIỆU QUÝ

Lan Chu Đinh (Spathoglottis Blume 1825 Viết Tắt Spa.)

Những chậu lan với vài cành lơ thơ dăm ba chiếc hoa mầu tím sẫm, thân lá xác sơ còi cọc, tôi đã nhìn thấy ở đâu đó trong buổi thiếu thời chẳng mang lại cho tôi một ý niệm đẹp nào về loài lan này cả.

Sau này di cư vào Nam, thấy những chậu lan này cũng khá đẹp vì khí hậu nóng bức và độ ẩm cao hơn, nhất là ở miền sông nước Hậu Giang, và trong những chuyến về thăm quê hương từ Bắc, Trung, Nam cho tới Phú quốc tôi thấy khá nhiều chậu lan Chu Đinh nhưng cũng không thấy gì hấp dẫn cho lắm. Có lẽ người chơi, trồng cây lan trong chậu rồi bỏ mặc cho mưa nắng dãi dầu từ năm này qua năm khác không hề thay chậu hoặc bón phân.

Lan Chu Đinh (Spathoglottis Blume 1825 viết tắt Spa.)

Trong những phiên họp của Hội Hoa Lan Việt Nam đã có nhiều hội viên mang cây lan này đến trưng bầy, nhưng không có gì đặc sắc cho lắm. Ngay cả khi tìm hiểu về những loài lan của quê hương Việt Nam, tôi cũng chỉ coi cây lan này như những cây lan khác. Nhưng đến năm 2009 khi nhìn thấy tận mắt những chậu lan này tại cuộc Triển Lãm Quốc Tế về Cây cảnh do Hoàng Gia Thái Lan (Royal Thai International Horticultural Exposition) tổ chức tại Chieng Mai, tôi mới thực sự nhìn thấy vẻ đẹp choáng ngợp của loài lan này.

Lan Sapthoglottis mọc khắp Á châu cho đến các quần đảo ở Nam bán cầu, Úc Châu và lan tràn tới Hawaii và Caribbean. Thổ dân đảo Molucca nấu lá cây lan để chữa bệnh thấp khớp. Những cây lan nguyên thủy, mọc ngoài thiên nhiên hoa không mở rộng như những cây đã lai giống. Tại các quốc gia như Thái Lan, Phi Luật Tân và Hawaii người ta trồng lan này làm cây cảnh trang trí trong vườn vì lá xanh ngắt, hoa mầu sắc rực rỡ và không phải mất nhiều thời gian chăm sóc.

Spathoglottis là một loài điạ lan có nhiều mầu sắc, rất dễ trồng và đặc biệt phát triển rất mau lẹ. Lan có thể mọc ở ngoài trời, ngoại trừ ở miền Nam California cần phải có lưới che để khỏi bị cháy lá và có thể chịu lạnh tới 4°C hay 35-40°F trong một vài giờ.

Dò hoa mọc từ đáy củ, cao khoảng 50-60 phân. Hoa tuy không thơm nhưng mầu sắc huy hoàng lộng lẫy. Mỗi dò chừng 8-15 hoa nở liên tiếp và trong 2-3 tháng mới tàn hết hoa nếu được tưới nước và bón phân đều đặn và có độ ẩm từ 60-70%. Nếu trồng trên đất nên chọn vật liệu thật xốp và thoát nước. Nếu trồng trong chậu nên dùng chậu có đáy sâu cho rễ ăn xuống. Nên nhớ củ lan rất dễ bị thối cho nên chỉ vùi sâu 1/3 mà thôi. Khi tách nhánh không cần phải có nhiều củ như các loài lan khác.

Hiện nay có nhiều người lai giống loài Spathoglottis này, nổi tiếng hơn cả là vườn lan của Rolita Spowart ở Phi luật Tân. Rolita Spowart là Đệ nhất phó hội trưởng Hội hoa lan Phi Luật Tân và là Tổng Giám đốc công ty VS Orchid Farm.

Với 3 trang trại ở các cao độ khác nhau, thời tiết khí hậu khác nhau cho nên công ty này đã tạo ra nhiều giống lan mầu sắc đẹp đẽ, hoa nhiều, cánh mở rộng phần lớn được lai giống từ cây 2 cây Spathoglottis plicata và cây Spathoglottis kimballiana mọc tại Borneo và Phi luật tân, hoa vàng rất lớn 7,5 phân lớn hơn Spathoglottis plicata rất nhiều chỉ to 3-4 phân.

Cây Spathoglottis plicata mà người Việt gọi là Chu đinh tím có lẽ mầu này rất phổ thông, nhưng thực ra cây này có rất nhiều biệt dạng với mầu sắc khác nhau từ vàng hồng, trắng tím thẫm, tím nhạt, được lai giống với cây Spathoglottis kimballina tuy ít hoa, nhưng mầu vàng tuyệt đẹp và cũng có khá nhiều biệt dạng cho nên đã tạo ra rất nhiều cây lai giống cho nhiều hoa, mầu sắc lộng lẫy, hoa mở rộng.

Những cây Spathoglottis đã được lai giống còn rất nhiều và sẽ được tiếp tục lai tạo. Chúng ta hãy chờ xem những cây lan mầu sắc đẹp đẽ, hoa nhiều, lâu tàn và mùa hoa kéo dài chẳng khác gì những cây Cymbidium.

Tiếc thay những cây lan Spathoglottis xinh đẹp này lại thuộc vào một loài “Hữu sắc vô hương”.

Hoàn Thiện Quy Trình Nhân Giống Lan Kim Tuyến (Anoectochilus Setaceus Blume)

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2KHOA SINH – KTNN===o0o===

PHẠM THỊ NHUNG

HOÀN THIỆN QUY TRÌNHNHÂN GIỐNG LAN KIM TUYẾN(ANOECTOCHILUS SETACEUS BLUME)BẰNG KĨ THUẬT NUÔI CẤY MÔ TẾBÀO

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌCChuyên ngành: Sinh lý học thực vật

HÀ NỘI, 2016

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2KHOA SINH – KTNN===o0o===

PHẠM THỊ NHUNG

HOÀN THIỆN QUY TRÌNHNHÂN GIỐNG LAN KIM TUYẾN(ANOECTOCHILUS SETACEUS BLUME)BẰNG KĨ THUẬT NUÔI CẤY MÔ TẾBÀOKHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌCChuyên ngành: Sinh lý học thực vật

Người hướng dẫn khoa học:TS. La Việt Hồng

HÀ NỘI, 2016

LỜI CẢM ƠNTrước hết tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc đếnTS. La Việt Hồng đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện giúpđỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài.Tôi xin chân thành cảm ơn ban Lãnh đạo trường Đại học Sư phạm HàNội 2, Ban chủ nhiệm khoa Sinh – KTNN trường học Sư phạm Hà Nội 2, đãtạo mọi điều kiện cho tôi học tập và hoàn thành khóa luận này.Trong thời gian thực hiện đề tài tôi cũng nhận được sự giúp đỡ tậntình của cô Mai Thị Hồng – Phòng thí nghiệm Sinh lý thực vật đã giúp đỡ,đóng góp ý kiến để tôi hoàn thành khóa luận này, nhân đây tôi cũng xinchân thành cảm ơn.Cuối cùng tôi xin cảm ơn gia đình và bạn bè đã động viên, tạo mọiđiều kiện giúp đỡ tôi trong suốt thời gian tôi học tập cũng như hoàn thànhkhóa luận.Mặc dù đã hết sức cố gắng nhưng do điều kiện thời gian và trình độchuyên môn còn nhiều hạn chế nên không tránh khỏi những thiếu sót, tôirất mong nhận được sự góp ý của quý thầy cô để khóa luận của tôi có thểhoàn thiện hơn.Tôi xin chân thành cảm ơn!Hà Nội, ngày 12 tháng 04 năm 2016Sinh viên

Phạm Thị Nhung

LỜI CAM ĐOANTôi xin cam đoan kết quả nghiên cứu đề tài: “Hoàn thiện quy trìnhnhân giống lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume) bằng kỹthuật nuôi cấy mô tế bào” là kết quả nghiên cứu của riêng tôi do TS. La ViệtHồng hướng dẫn. Các số liệu, kết quả trong nghiên cứu này là trung thực vàchưa được ai công bố.Hà Nội, ngày 12 tháng 04 năm 2016Sinh viên

Phạm Thị Nhung

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

NAA:

Napthlacetic acid

BAP:

6-Benzyl amino purin

KI:

Kinetin

MS:

Murashige và Skoog

Nxb:

Nhà xuất bản

CT:

Công thức

ĐC:

Đối chứng

TDZ:

Thidiazuron

MỤC LỤCMỞ ĐẦU ………………………………………………………………………………………….. 11. Lý do chọn đề tài …………………………………………………………………………. 12. Mục đích nghiên cứu ……………………………………………………………………. 33. Nội dung nghiên cứu ……………………………………………………………………. 34. Phạm vi nghiên cứu ……………………………………………………………………… 35. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn ……………………………………………. 3NỘI DUNG ……………………………………………………………………………………….. 4Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ……………………………………………………. 41.1. Giới thiệu về cây lan Kim tuyến………………………………………………….. 41.1.1. Phân loại ……………………………………………………………………………. 41.1.2. Đặc điểm thực vật học ………………………………………………………….. 41.1.3. Sinh học và sinh thái ……………………………………………………………. 51.1.4. Phân bố ………………………………………………………………………………. 51.1.5. Công dụng của lan Kim tuyến ……………………………………………….. 51.1.6. Thực trạng khai thác và phát triển cây lan Kim tuyếnở Việt Nam …………………………………………………………………………………… 81.1.7. Các loài lan Kim tuyến có ở Việt Nam ……………………………………. 81.2. Tình hình nghiên cứu về nhân giống và bảo tồn lan Kim tuyến …….. 101.2.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới ……………………………………….. 101.2.2. Tình hình nghiên cứu trong nước ………………………………………….. 12Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ……………….. 152.1. Vật liệu thực vật ……………………………………………………………………… 152.2. Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm ………………………………………………….. 152.2.1. Dụng cụ ……………………………………………………………………………. 152.2.2. Thiết bị ……………………………………………………………………………… 152.3. Môi trường nuôi cấy ………………………………………………………………… 15

2.4. Điều kiện nuôi cấy in vitro ……………………………………………………….. 152.5. Phương pháp nghiên cứu ………………………………………………………….. 162.5.1. Bố trí thí nghiệm ………………………………………………………………… 162.5.3. Phương pháp phân tích thống kê kết quả thực nghiệm ……………. 18Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN …………………….. 193.1. Hoàn thiện giai đoạn tái sinh lan Kim tuyến in vitro ……………………. 193.2. Hoàn thiện giai đoạn ra rễ tạo cây lan Kim tuyến in vitrohoàn chỉnh…………………………………………………………………………………….. 223.3. Hoàn thiện giai đoạn rèn luyện cây lan Kim tuyến với điều kiệntự nhiên ………………………………………………………………………………………… 24KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ……………………………………………………………. 26TÀI LIỆU THAM KHẢO ……………………………………………………………….. 27

DANH MỤC CÁC BẢNGBảng 2.1: Ảnh hưởng của BAP và Kinetin đến khả năng tạo cụm chồicây lan Kim tuyến ………………………………………………………………17Bảng 2.2: Ảnh hưởng của α – NAA đến tạo rễ của cây lan Kim tuyếnin vitro………………………………………………………………………………17Bảng 2.3: Ảnh hưởng của giá thể tới tỉ lệ sống của lan Kim tuyếnin vitro………………………………………………………………………………18Bảng 3.1. Kết quả tái sinh chồi lan Kim tuyến (số chồi/mẫu) ………………..19Bảng 3.2. Ra rễ tạo cây hoàn chỉnh in vitro lan Kim tuyếnBảng 3.3. Rèn luyện cây in vitro ngoài tự nhiên

………………..23

………………………………24

DANH MỤC CÁC HÌNHHình 1.1. Lan Kim tuyến Anoectochilus setaceus Blume ………………………. 4Hình 2.1. Sơ đồ nghiên cứu ………………………………………………………………… 16Hình 3.1. Cụm chồi lan Kim tuyến ……………………………………………………… 21Hình 3.2. Ra rễ tạo cây hoàn chỉnh in vitro từ chồi lan Kim tuyến…………… 23Hình 3.3. Rèn luyện cây lan Kim tuyến ngoài môi trường tự nhiên ở cácgiá thể khác nhau ………………………………………………………………… 25

MỞ ĐẦU1. Lý do chọn đề tàiLan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume) thuộc họ Phong lan(Orchidaceae) là loại thảo dược quý hiếm của Việt Nam [1]. Ở nước ta, câylan Kim tuyến mọc rải rác ở trong rừng núi đá vôi, nơi ẩm, dọc theo khesuối, ở độ cao 300-1000 m như Sa Pa (Lào Cai), Quản Bạ (Hà Giang), TamĐảo (Vĩnh Phúc), Mĩ Đức (Hà Tây)… Lan Kim tuyến được cấp báo thuộcnhóm IA của Nghị định 32/2006/CP, nghiêm cấm khai thác vì mục đíchthương mại [3] và nhóm thực vật rừng đang nguy cấp EN A1a, c, d, trongsách đỏ Việt Nam [4].Trong y học, lan Kim tuyến được sử dụng làm thuốc trị lao phổi, ho dophế nhiệt, phong thấp, đau nhức khớp xương, chấn thương, viêm dạ dàymãn tính, viêm khí quản, viêm gan mãn tính, suy nhược thần kinh, giúp tăngcường sức khoẻ, làm khí huyết lưu thông, có tính kháng khuẩn [24].Phương pháp nhân giống in vitro có khả năng khắc phục được nhiều trởngại mà những phương pháp nhân giống khác thường gặp, sau đây là nhữngưu điểm chính: cây con được trẻ hóa và sạch bệnh, vì vậy có tiềm năng sinhtrưởng, phát triển và đạt năng suất cao. Tạo cây con đồng nhất về mặt ditruyền, bảo tồn được các tính trạng đã chọn lọc. Tạo được dòng thuần củacác cây tạp giao. Tạo được cây có gen mới (đa bội, đơn bội). Bảo quản vàlưu trữ tập đoàn gen. Có khả năng sản xuất quanh năm. Có thể nhân nhanhnhiều cây không kết hạt trong những điều kiện sinh thái nhất định hoặc hạtnảy mầm kém. Hệ số nhân giống cực cao, rút ngắn thời gian đưa một giốngmới vào sản xuất đại trà [2].Về phương diện hệ số nhân giống, nhân giống in vitro là phương phápkhông gì có thể so sánh kịp, kể cả phương pháp nhân giống bằng hạt. Theo

Phạm Thị Nhung

1

Mai Thị Tân và cộng sự đã đạt được hệ số nhân 532 trong vòng một năm đốivới cây khoai tây bằng phương pháp này [11].Quá trình nhân giống cây trồng trong môi trường in vitro gồm nhiềugiai đoạn khác nhau gồm: (i) tạo vật liệu khởi đầu; (ii) nhân nhanh chồi; (iii)ra rễ cho chồi in vitro và (iv) chuyển cây ra rèn luyện với điều kiện tự nhiên.Mỗi giai đoạn có những yêu cầu riêng. Trong đó giai đoạn quan trọng nhấtquyết định sự thành công của quy trình nuôi cấy là giai đoạn nhân nhanhchồi và giai đoạn rèn luyện cây con thích nghi với môi trường tự nhiên [21].Tại Việt Nam cũng đã có một số công bố về nhân giống và bảo tồn lanKim tuyến như: Nguyễn Quang Thạch và cộng sự (2012) đã tìm ra môitrường nhân nhanh thích hợp nhất cho thể chồi và mắt đốt ngang thân làKnud* + 0,5 mg/l BAP + 0,3 mg/l Kinetin + 0,3 mg/l α-NAA + 20 g/lsucrose + 0,5 g/l than hoạt tính + 7 g agar/l đạt hệ số nhân chồi là 6,55chồi/mẫu [13]. Năm 2014, tác giả Trần Thị Hồng Thúy và cộng sự đã tìm ramôi trường Knudson C lỏng chứa 1% saccarozơ, 100 ml.L-1 nước dừa và0,5 mg.L-1 Kinetin, tỉ lệ hình thành PLBs đạt 86,25%, PLBs sinh trưởng tốt[14], tác giả Đỗ Mạnh Cường và cộng sự (2015) nghiên cứu ảnh hưởng củamột số yếu tố lên quá trình sinh trưởng và phát triển của cây lan Gấm(Anoectochilus setaceus Blume) nuôi cấy in vitro [5]… Tuy nhiên, việcnghiên cứu này mới chỉ dừng lại ở một số giai đoạn mà chưa hoàn thiệnđược quy trình nhân giống cây lan này. Do vậy, tôi quyết định nghiên cứuđề tài: “Hoàn thiện quy trình nhân giống lan Kim tuyến (Anoectochilussetaceus Blume) bằng kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào” nhằm cải thiện mộtsố giai đoạn của quy trình nhân giống in vitro loài lan này với mục đích bảotồn và phát triển được nguồn giống lan Kim tuyến, cung cấp cây giống cóchất lượng cho thị trường.

Phạm Thị Nhung

2

2. Mục đích nghiên cứuHoàn thiện quy trình nhân nhanh loài lan Kim tuyến (Anoectochilussetaceus Blume) bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào, nhằm góp phần bảotồn và phát triển loài lan dược liệu quý hiếm của Việt Nam, đáp ứng nhu cầucây lan Kim tuyến giống phục vụ nhu cầu con người.3. Nội dung nghiên cứuHoàn thiện giai đoạn nhân nhanh giống cây lan Kim tuyến bằng kỹthuật nuôi cấy mô tế bào thực vật.Hoàn thiện giai đoạn ra rễ của lan Kim tuyến in vitro.Hoàn thiện giai đoạn rèn luyện cây con lan Kim tuyến in vitro.4. Phạm vi nghiên cứuPhòng thí nghiệm Sinh lí thực vật, khoa Sinh – KTNN, trường Đại họcSư phạm Hà Nội 2.5. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn5.1. Ý nghĩa khoa họcGóp phần bổ sung vào nguồn tài liệu nghiên cứu về nhân giống in vitrocây lan Kim tuyến.5.2. Ý nghĩa thực tiễnTạo ra được nguồn cây giống với số lượng lớn và sạch bệnh cung cấpcho thị trường.Góp phần bảo tồn được nguồn gen của loài lan Kim tuyến.

Phạm Thị Nhung

3

NỘI DUNGChương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Giới thiệu về cây lan Kim tuyến1.1.1. Phân loạiGiới: Plantea (Thực vật)Bộ: AsparagalesHọ: OrchidaceaePhân họ: OrchidoideaeChi: AnoectochilusLoài: A. setaceusTên khoa học: Anoectochilussetaceus BlumeTên Việt Nam: Lan Kim tuyến

Hình 1.1. Lan Kim tuyếnAnoectochilus setaceus Blume

Tên gọi khác: Lan Gấm

[24]

1.1.2. Đặc điểm thực vật họcCây ưa độ ẩm cao và ưa bóng râm, kỵ ánh sáng, yêu cầu đất nhiềumùn, tơi xốp, thoáng khí. Cây bò trên mặt đất cao 10 – 20 cm, thân màutím, mọng nước, phần cây non có nhiều lông mềm, mang 2 – 6 lá mọccách, xòe trên mặt đất [24].Lá hình trứng, gần tròn ở gốc, chóp hơi nhọn và có mũi ngắn, cỡ 3 – 4x 2 – 3 cm, có màu khác nhau với mạng gân thường nhạt hơn (màu lục sẫm

Phạm Thị Nhung

4

với mạng gân màu lục nhạt hay màu nâu – đỏ với mạng gân màu vàng – lụchay hồng); cuống lá dài 2 – 3 cm [3].Cụm hoa dài 10 – 15 cm, mang 4 – 10 hoa mọc thưa. Lá bắc hìnhtrứng, chóp thót nhọn, dài 8 – 10 mm, màu hồng. Hoa thường màu trắng, dài2,5 – 3 cm; các mảnh bao hoa dài khoảng 6 mm; môi dài đến 1,5 cm, ở mỗibên gốc mang 6 – 8 dải hẹp, chóp phiến rộng, chẻ hai sâu, hốc chứa mật dài7 mm, bầu dài 1,3 cm, màu lục, có nhiều lông mềm [3].1.1.3. Sinh học và sinh tháiMùa hoa tháng 2 – 4. Tái sinh bằng chồi từ thân rễ và hạt, ít và sinhtrưởng rất chậm. Mọc dưới tán rừng nguyên sinh, hầu hết là nguyên thủy,rậm thường xanh nhiệt đới mưa mùa cây lá rộng trên sườn núi đá granit,riôlit, phiến sét, ở độ cao 500 – 1600 m, rải rác thành từng nhóm vài ba câytrên đất ẩm, rất giàu mùn và lá cây rụng [3].1.1.4. Phân bốTrong nước: Lào Cai (Sapa: Phăng Xi Păng, Văn Bàn: Liêm Phú), HàTĩnh (Hương Sơn: Rào Àn), Quảng Trị, Kontum (Đắk Glei: núi Ngọc Linh,Sa Thầy: núi Chư Mom Ray), Đắk Lắk (Krông Bông: núi Chư Yang Sinh),Lâm Đồng (Lạc Dương: núi Bì Đúp) [3].Thế giới: Ấn Độ, Nêpan, Butan, Trung Quốc, Mianma, Thái Lan, Lào,Campuchia, Malaixia, Inđônêxia [3].1.1.5. Công dụng của lan Kim tuyếnTheo các tài liệu của Đài Loan thì lan Kim tuyến là một loại cây thuốcvô cùng quý giá, có bán tại các tiệm thuốc Bắc và được sử dụng phổ biếntrong nhân dân. Cây lan Kim tuyến có các tác dụng như: tăng cường sứckhỏe, làm khí huyết lưu thông; có tác dụng kháng khuẩn, chữa các bệnhviêm khí quản, viêm gan mãn tính; chữa thần kinh suy nhược, chữa ho khan,

Phạm Thị Nhung

5

đau họng, cao huyết áp, suy thận, chữa di tinh, đau lưng, phong thấp, làmtiêu đờm, giải độc, giải nhiệt… Và thường dùng cả cây tươi hoặc khô để sắcuống, liều thường dùng trong ngày là khoảng 20 g tươi hoặc 5 g khô [25].Ông Tả Mộc Thuấn – học giả người Nhật (năm 1924), nghiên cứu vềTrung y đã cho biết: Kim tuyến liên là một trong những cây thuốc quý trongdân gian; toàn thân cây thuốc được dùng để làm tăng cường sức khỏe, chủtrị bệnh phổi, di tinh, xuất tinh sớm, yếu gan, yếu tỳ và các vết thương dorắn cắn; còn có tác dụng bổ máu, giải nhiệt [25].Ông Sơn Điền Kim Trị (1932) cũng đã cho biết: Người dân tộc miềnnúi thường dùng Kim tuyến liên sắc uống để trị đau ruột, đau bụng, sốt cao,đắp bên ngoài để trị các chỗ sưng vết thương và chỗ bị rắn cắn [25].Trong sách Thanh thảo gia đình tự liệu pháp của ông Trần Đào Thíchcó viết: Trẻ em hay khóc dùng Kim tuyến liên sắc uống sẽ khỏi [25].Trong sách Khoa học quốc dược quyển I kỳ 2 (năm 1958) của ông TạA Mộc và Trần Kiến Đào đăng tải trong tạp chí Đài Loan dân gian dượcdụng thực vật, có nói đến Kim tuyến liên là một trong những dược thảo quýgiá, giúp bổ máu, dưỡng âm, chữa trị nóng phổi và nóng gan [25].Trong báo cáo điều tra năm 1964, ông Cam Vĩ Tùng đã cho biết: Kimtuyến liên là một vị thuốc hết sức quý giá trong các tiệm thuốc bắc ĐàiLoan, là cây thuốc mang tính mát và có vị ngọt, thanh nhiệt, thanh huyết, bổphổi, giải trừ u uất, thông trung khí, bồi dưỡng sức khỏe, chủ trị lục phủ ngũtạng đẩy lùi tâm hỏa, nóng gan, bệnh phổi, thổ huyết, ho hen, đau ngực, đaulá lách, đau cuống họng, cao huyết áp, trẻ con chậm lớn, suy thận [25].Trung y sư Thái Cát Hùng, Chủ tịch Hội đồng quản trị của Hội nghiêncứu cây thuốc thực vật thành phố Gia Nghĩa cho biết: Kim tuyến liên tiêuđờm, giải độc, hạ huyết áp, trợ tim, lợi tiểu, trị bệnh đái đường, chữa viêmgan, trị mụn và thường dùng cây tươi sắc uống [25].

Phạm Thị Nhung

6

Trong y học hiện đại bằng nhiều công trình nghiên cứu khoa học, cácnhà khoa học ở nhiều Viện và Trường đại học Y trên thế giới đã cung cấpcác bằng chứng cho thấy nhiều công dụng của lan Gấm – lan Kim tuyến như[26]:Điều trị ung thư: “Các chất chiết xuất từ thực vật Chi Lan Kim TuyếnA. formosanus và các thành phần có nguồn gốc từ nó được sử dụng như làcác loại thuốc thảo dược hoặc các chất bổ sung dinh dưỡng để ngăn ngừahóa chất (chemoprevention) hoặc điều trị bệnh lý ác tính của con người”.Nghiên cứu này đã được cấp bằng sáng chế ở Mỹ (US 7033617 B2).Tăng cường miễn dịch: Chi Lan Kim Tuyến có tiềm năng tăng cườnghệ miễn dịch. Các kết quả nghiên cứu cho thấy những tác dụng tăng cườnghệ miễn dịch rất quý của dịch chiết Chi Lan Kim Tuyến.Bảo vệ gan – Giải độc rượu: tác dụng bảo vệ gan, giải độc rượu củaChi Lan Kim Tuyến đã được chứng minh bằng nhiều công trình khoa học.Dung dịch nước chiết xuất của Chi Lan Kim Tuyến formosanus đã chothấy hoạt động bảo vệ gan đáng kể so với silymarin tiêu chuẩn. Các nghiêncứu độc tính cấp đã kết luận rằng nó có thể được coi là an toàn trong mộtthời gian dài.Điều trị tiểu đường: kinsenoside là một hợp chất hoạt tính sinh học cơbản có trong lan Gấm. Nó thể hiện các hiệu ứng dược lý như chống mỡmáu, chất chống oxy hóa, chống viêm, tăng cường miễn dịch, và các hoạtđộng bảo vệ gan và gần đây đã được phát triển như là một ứng cử viênthuốc trị đái tháo đường.Chống loãng xương: chiết xuất Chi Lan Kim Tuyến formosanus(arabinogalactan prebiotic) làm tăng hấp thu canxi và ngăn chặn sự tiêuxương.Bồi bổ cơ thể: rất nhiều khoáng chất hữu cơ và axit amin có trong lanKim tuyến giúp bồi bổ cơ thể phục hồi khí huyết.

Phạm Thị Nhung

7

1.1.6. Thực trạng khai thác và phát triển cây lan Kim tuyến ở Việt NamỞ Việt Nam, lan Kim tuyến có phân bố rộng nhưng với số lượng cá thểkhông nhiều, tái sinh chậm đòi hỏi điều kiện sống ngặt nghèo ngày cànghiếm.Theo khảo sát, nước ta có tới 15 loài lan Gấm phân bố rải rác ở rừngnhiều tỉnh, có thể tập hợp lại, trồng, xuất khẩu thu lợi nhuận. Tuy nhiên,cách khai thác loại dược liệu quý này mới chỉ là dạng nhỏ lẻ [27].Đặc biệt, cách đây vài năm, rộ lên cơn sốt lan Gấm khi các đầu mốiHàn Quốc, Đài Loan, Trung Quốc mua lại với giá khoảng 3,5 – 4 triệu đồng/1 kg tươi. Vì vậy, rất nhiều người dân đã lặn lội trong rừng sâu, lùng hái lálan Gấm để bán cho các đầu mối thu mua với giá khoảng 500 ngàn đồng1/kg lá tươi, dần dần khi khan hiếm, cạn kiệt, giá của lan Gấm được đẩy lên1,2 – 1,6 triệu đồng/1 kg lá tươi [27].Do bị thu hái nhiều để bán làm thuốc từ rất lâu, nên loài lan Kim tuyếnđang bị đe dọa nghiêm trọng, rất có thể sẽ bị tuyệt chủng ngoài tự nhiên nếukhông có biện pháp bảo tồn hữu hiệu. Hiện nay, lan Kim tuyến được xếptrong nhóm IA của Nghị Định 32/2006/NĐ-CP, nghiêm cấm khai thác vìmục đích thương mại [3].Phải chăng, đã đến lúc chúng ta phải có những đánh giá nghiêm túc,công trình nghiên cứu chính thức về giá trị tài nguyên của dược liệu quý,chẳng hạn như cây lan Gấm… Để từ đó, có được những hướng phát triểncũng như khai thác các loại dược liệu quý, thay vì để các doanh nghiệp nướcngoài lợi dụng sự thiếu hiểu biết của ta để trục lợi.1.1.7. Các loài lan Kim tuyến có ở Việt NamTheo GS. Phạm Hoàng Hộ (Cây cỏ Việt Nam, tập III), ở Việt Nam chilan Kim tuyến gồm có những loài sau [6]:+ Loài Anoectochilus daoensis Gagnep. Còn gọi là Giải thùy tam đảo,phân bố ở Tam Đảo.

Phạm Thị Nhung

8

Phạm Thị Nhung

9

+ Loài Anoectochilus Chapaensis Gagnep; còn gọi là Giải thùy Sa Pa,được phát hiện năm 1931, chỉ có ở Việt Nam, tìm thấy tại Lào Cai (Sa Pa),Thừa Thiên – Huế (Bạch Mã); thế giới chưa biết.+ Loài Anoectochilus setaceus Blume (tên khác là Anoectochilusroxburghii (Wall.) Lindl.); còn gọi là Giải thùy tơ, Giải thùy Roxburgh,Kim tuyến đỏ, Sứa hồng; được phát hiện năm 1825, phân bố ở Lào Cai (SaPa, Phăng Xi Păng, Văn Bàn: Liêm Phú), Hà Tĩnh (Hương Sơn, Rào Ân),Quảng Trị, Kon Tum ( Đắk Glei, núi Ngọc Linh, Sa Thầy: núi Chư MormRay), Đắk Lắk (Krông Bông, núi Chư Yang Sinh), Lâm Đồng (Lạc Dương,núi Bì Đúp).+ Loài Anoectochilus Tridentatus Seidenf. Ex Aver; còn gọi là Giảithùy Ba Răng, được phát hiện năm 1990, chỉ có ở Việt Nam, mới tìm thấyở Vĩnh Phúc (Tam Đảo); thế giới chưa biết.1.2. Tình hình nghiên cứu về nhân giống và bảo tồn lan Kim tuyến1.2.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giớiTrong những năm gần đây, trên thế giới đã có nhiều cơ sở nghiên cứutìm các biện pháp nhân giống loài lan Kim tuyến quý hiếm có nguy cơ bịtuyệt chủng.Gangaprasad A và cộng sự (2000) nghiên cứu vi nhân giống hai loàilan A. sikkimensis và A. regalis. Hai loài lan Kim tuyến này được nuôi cấytrên môi trường Woody Plant Medium (WPM) sau 12 tuần tỷ lệ callus đượctạo ra 4,8 – 5,6 và số chồi tương ứng 95 – 98%. Khi mẫu được cấy chuyểnsang môi trường tương tự trên thì số chồi bên tăng 21,4 và chồi đỉnh là 8,2đối với loài A. regalis. Còn đối với loài A. sikkimensis sự bật chồi chậm hơn,số chồi bên đạt 12,3 và chồi đỉnh là 4,3 [17].Với công trình nghiên cứu gieo hạt in vitro cây A. roxburghii, tác giảHuang H và cộng sự (2002) đã tìm ra được môi trường Knudson C có bổsung 0,5 mg/L BAP + 20% dịch khoai tây là thích hợp nhất cho sự phát triểnprotocom từ hạt của A. roxburghii [18].

Phạm Thị Nhung

10

Vi nhân giống cây A. formossanus được tác giả Ket N.V và cộng sự(2004) nghiên cứu nhằm mục tiêu bảo tồn nguồn gen quý có nguy cơ bịtuyệt diệt. Đã tìm ra môi trường nhân nhanh cụm chồi thích hợp nhất là môitrường Hyponex có bổ sung 1 g dm-3 Benzyl adenin hoặc 1 – 2 mg dm-3Thidiazuron (TDZ). Bổ sung 1 g dm-3 than hoạt tính vào môi trường có chứaTDZ thúc phát triển chồi (11,1 chồi/mô cấy). Tuy nhiên, tốc độ chồi tái sinhchậm và không kéo dài thân. Trên môi trường Hyponex bổ sung 2% đườngvà 0,5 g dm-3 than hoạt tính thích hợp cho sự phát triển cụm chồi và tỷ lệ câyra rễ là 100% [19].Y.J. Shiau và cộng sự (2005) nghiên cứu nhân giống loài lan Kimtuyến (Haemaria discolor (Ker) Lindl. var.) bằng phương pháp gieo hạt invitro. Các hạt sau khi nảy mầm cấy chuyển trên môi trường ½ MS bổ sung0,2% than hoạt tính, 8% dịch chuối, 0,1 mg dm-3 (TDZ) và 1,0 mg dm-3(NAA) cho cây sinh trưởng và phát triển tốt. Có tới 96% cây sống sau khichuyển ra nhà kính [22].Zhou YuMei và cộng sự (2009) đã nghiên cứu xây dựng quy trìnhnhân nhanh giống cây A. formosanus. Kết quả cho thấy: Môi trường tối ưucho nhân nhanh chồi là môi trường MS có bổ sung 0,1 mg/l TDZ, 5% nướcdừa và 3% đường. Môi trường thích hợp cho rễ phát triển là môi trườngMS bổ sung 0,1 mg/l BAP + 0,5 mg/l indol 3 – butyric acid (IBA) và 2 g/lthan hoạt tính. Giá thể ra cây trong vườn ươm tốt nhất là rêu và sử dụngdinh dưỡng Hyponex 2 (20: 20: 20) bón tốt nhất cho cây A. formosanustrong vườn ươm [23].Nghiên cứu kĩ thuật nuôi cấy đỉnh sinh trưởng nhằm mục tiêu bảo tồnvà phát triển cây A. elatus Lindley, tác giả N. Ahamed Sherif và cộng sự(2012) đã sử dụng chồi đỉnh và chồi bên làm vật liệu nuôi cấy. Trên môi

Phạm Thị Nhung

11

trường MS có bổ sung 3,0 mg/l TDZ và 3,5 mg/l KI thích hợp nhất cho nhânnhanh cụm chồi. Tỷ lệ ra rễ đạt cao nhất khi bổ sung vào môi trường 0,3 g/lthan hoạt tính [16].Từ các kết quả trên cho thấy trên thế giới đã có nhiều công trình nghiêncứu đối với loài lan Kim tuyến. Các kết quả này có ý nghĩa quan trọng trongviệc giúp các nhà nghiên cứu nước ta kế thừa kinh nghiệm để đem lại hiệu quảcao trong việc nhân giống và bảo tồn lan Kim tuyến trong điều kiện Việt Nam.1.2.2. Tình hình nghiên cứu trong nướcCây lan Kim tuyến đang có nguy cơ tuyệt chủng do khai thác quá mức.Vì vậy, trong những năm gần đây, ở Việt Nam cũng đã có nghiên cứu về loàilan này nhằm phát triển và bảo tồn nguồn dược liệu quý.Phùng Văn Phê và cộng sự (2010) đã nghiên cứu kỹ thuật nhân nhanhchồi in vitro lan Kim tuyến Anoectochilus roxburghii (Wall.) Lindl. Kết quảcho thấy: môi trường phù hợp nhất để nhân nhanh chồi Lan Kim tuyến invitro là Knud*. Thể chồi 8 tuần tuổi từ phôi hạt chín và chồi từ thể chồi cao từ2-3 cm là phù hợp nhất để nhân nhanh trong môi trường thích hợp Knud* bổsung 0,5 mg/l BAP + 0,3 mg/l KI + 0,3 mg/l NAA + 100 ml/l ND + 100 g/ldịch chiết khoai tây + 20 g/l saccarozơ + 7 g/l agar + 0,5 g/l than hoạt tính [9].Phùng Văn Phê và cộng sự (2010) đã nghiên cứu đặc điểm hình thái,phân bố của loài lan Kim tuyến Anoectochilus setaceus Blume ở vườn quốcgia Tam Đảo, tỉnh Vĩnh Phúc [10].Nguyễn Quang Thạch và cộng sự (2012) đã nghiên cứu kỹ thuật nhângiống loài lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume) in vitro bảo tồnnguồn dược liệu quý. Kết quả cho thấy: cơ quan vào mẫu phù hợp nhất làthể chồi và mắt đốt ngang thân được khử trùng và đưa vào các môi trườngnền khác nhau (MS, Knud, Knudson). Tiếp đó, các chồi và mắt đốt đượcchuyển sang môi trường nền thích hợp có bổ sung BAP, KI, α – NAA trong

Phạm Thị Nhung

12

4 tuần. Môi trường thích hợp nhất để nhân nhanh thể chồi và mắt đốt ngangthân là Knud* + 0,5 mg/l BAP + 0,3 mg/l KI + 0,3 mg/l NAA + 20 g/lsaccarozơ + 0,5 g/l than hoạt tính + 7 g agar/l cho hệ số nhân chồi là 6,55chồi/mẫu. Các chồi có chiều cao từ 3 – 4 cm được sử dụng để ra rễ in vitro.Tỷ lệ ra rễ là 100% và số rễ/chồi (4,21 rễ/chồi) đạt cao nhất trên môi trườngcó bổ sung 1 mg/l α – NAA [13].Nghiên cứu ảnh hưởng của Kinetin và sự kết hợp giữa Kinetin và 2,4 D đến quá trình hình thành protocom-like bodies ở cây lan Kim tuyến(Anoectochilus setaceus Blume), tác giả Trần Thị Hồng Thúy và cộng sự(2014). Trong nghiên cứu này, chồi của cây lan Kim tuyến được sử dụnglàm nguyên liệu ban đầu để cảm ứng hình thành PLBs trong môi trườngKnudson C lỏng chứa 100 ml.L-1 nước dừa và bổ sung Kinetin hoặc sự kếthợp giữa Kinetin với 2,4-D. Kết quả cho thấy PLBs được hình thành tốt nhấttrên môi trường Knudson C lỏng chứa 1% saccarozơ, 100 ml.L-1 nước dừavà 0,5 mg.L-1 Kinetin, tỉ lệ hình thành PLBs đạt 86,25%, PLBs sinh trưởngtốt. Trong khi đó, sự kết hợp giữa 2,4-D ở nồng độ 0,5 mg.L-1 với một sốnồng độ của Kinetin (0,5; 1,0; 1,5 mg.L-1) không có tác dụng lớn trong việccảm ứng hình thành PLBs ở cây lan Kim tuyến [14].Ảnh hưởng của một số yếu tố lên quá trình sinh trưởng và phát triểncủa cây lan Gấm (Anoectochilus setaceus Blume) nuôi cấy in vitro, tác giảĐỗ Mạnh Cường và cộng sự (2015). Sau 2 tháng nuôi cấy, kết quả cho thấy,trên môi trường SH (Schenk and Hildebrandt, 1972) có bổ sung 1,0 mg/l BAcó sự khác biệt đáng kể về chiều cao chồi, khối lượng tươi và khối lượngkhô (6,70 cm; 1,41 g và 0,1751 g; tương ứng), đặc biệt số đốt (6,33 đốt/mẫu)đạt cao nhất so với các nghiệm thức khác. Sau đó, các đốt thân tiếp tục đượcnuôi cấy trên môi trường bổ sung 1,0 mg/l BAP kết hợp α-NAA ở các nồngđộ khác nhau nhằm tìm ra môi trường thích hợp cho quá trình sinh trưởng và

Phạm Thị Nhung

13

phát triển của chồi cây lan Gấm. Sau 2 tháng nuôi cấy, trên môi trường cóbổ sung 1,0 mg/l BAP kết hợp 1,0 mg/l α – NAA các chồi có sự sinh trưởngvà phát triển tốt (chiều cao chồi: 9,03 cm; số đốt: 9,33 đốt/mẫu; khối lượngtươi: 2,63 g và khối lượng khô: 0,2187 g), hệ rễ phát triển mạnh (số rễ: 7,33rễ/mẫu; chiều dài rễ: 1,36 cm). Tuy nhiên, mẫu bị nâu hóa do lượng phenoltrong mẫu tiết ra nhiều. Để tối ưu hóa môi trường, các điều kiện nuôi cấy:lỏng tĩnh, lỏng lắc, agar, bông gòn đã được khảo sát. Kết quả cho thấy, cácchồi trên môi trường lỏng có bông gòn sinh trưởng tốt, to khỏe, hệ rễ pháttriển mạnh và đặc biệt không còn hiện tượng nâu hóa [5].Từ các kết quả trên cho thấy ở Việt Nam cũng đã có nhiều nghiên cứuvề việc nhân giống và bảo tồn lan Kim tuyến. Tuy nhiên, việc nghiên cứunày mới chỉ dừng lại ở một số đối tượng và chưa hoàn thiện được kỹ thuậttrồng, chăm sóc đầy đủ. Các kết quả nghiên cứu mới chỉ dừng lại ở mức độnghiên cứu trong phòng thí nghiệm, chưa được áp dụng vào sản xuất.

Phạm Thị Nhung

14

Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Vật liệu thực vậtCây lan Kim tuyến in vitro do Phòng Sinh lý thực vật, Khoa Sinh KTNN, trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 cung cấp.2.2. Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm2.2.1. Dụng cụDao cấy, khay cấy, kéo, túi nilon, bình tam giác, đèn cồn, bình xịt cồnvỉ xốp nuôi cấy,…2.2.2. Thiết bịCác thiết bị sử dụng trong nuôi cấy mô thực vật: cân kĩ thuật, máy đopH, nồi hấp khử trùng, máy cất nước hai lần, buồng cấy vô trùng, máykhuấy từ ra nhiệt,…2.3. Môi trường nuôi cấyCác thí nghiệm nuôi cấy in vitro đều sử dụng môi trường dinh dưỡngcơ bản (Murashige và Skoog, 1962) [20]: MS + 30 g/l đường saccarozơ + 7g/l agar và các chất điều hòa sinh trưởng.pH môi trường: 5,8Môi trường được khử trùng trong nồi hấp khử trùng ở nhiệt độ 117oCtrong 15 phút.2.4. Điều kiện nuôi cấy in vitroCác thí nghiệm đều được thực hiện trong điều kiện nhân tạo.Thời gian chiếu sáng: 16 giờ sáng/8 giờ tối.Nhiệt độ: 25 ± 2o C.Độ ẩm: 70 – 80%Cường độ ánh sáng: 2000 lux.

Phạm Thị Nhung

15

2.5. Phương pháp nghiên cứu2.5.1. Bố trí thí nghiệmNghiên cứu được tiến hành gồm 3 thí nghiệm, các thí nghiệm được bốtrí theo sơ đồ hình 2.1.Cây lan Kim tuyến in vitro+ BAP

+ Kinetin

Nhân nhanh lan Kim tuyến+ NAATạo cây lan Kim tuyến in vitro hoàn chỉnh

+ Xơ dừa, đất, phân bòRèn luyện cây in vitro ngoài môi trường tự nhiênHình 2.1. Sơ đồ nghiên cứuCác thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 lầnnhắc lại.2.5.2. Phương pháp nghiên cứu2.5.2.1. Thí nghiệm 1: Hoàn thiện giai đoạn nhân nhanh lan Kim tuyến bằngkỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vậtThí nghiệm tiến hành trên môi trường cơ bản: MS + 30 g/l đường, 7 g/lagar có bổ sung KI và BAP với nồng độ như sau:

Phạm Thị Nhung

16

Bạn đang đọc nội dung bài viết Loài Lan Grammatophyllum Blume trên website Vitagrowthheight.com. Hy vọng một phần nào đó những thông tin mà chúng tôi đã cung cấp là rất hữu ích với bạn. Nếu nội dung bài viết hay, ý nghĩa bạn hãy chia sẻ với bạn bè của mình và luôn theo dõi, ủng hộ chúng tôi để cập nhật những thông tin mới nhất. Chúc bạn một ngày tốt lành!